基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法。该试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有副猪嗜血杆菌，并测定其含量。本发明专利技术具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，可实现副猪嗜血杆菌病诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

【技术实现步骤摘要】
基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法
本专利技术涉及一种副猪嗜血杆菌测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，属于分子生物学

技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌。在一定条件下可引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，该病原引起的疾病又称为格氏病。副猪嗜血杆菌有15个以上血清型，血清1、5、10、12、13和14型是引发猪发病和死亡的强毒血清型；血清型2、4和15是可引起多发性浆膜炎的中等独立型；血清型8属于弱毒力型，血清型3、6、7、9和11为不引起临床症状的无毒力型，我国以血清4和5型流行最多。副猪嗜血杆菌病死亡率较高，病发后不易治愈，病死率高达50％。该病传染性强，且多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康。该病在我国已呈现出流行趋势，给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，建立早期快速检测方法对副猪嗜血杆菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。目前，实验室常用的检测副猪嗜血杆菌的方法有细菌分离、血清学诊断技术(补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。数字环介导等温扩增技术(digitalloop-mediatedisothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其他非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。为了解决上述传统方法检测副猪嗜血杆菌面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，能够应用于副猪嗜血杆菌的快速、精准检测。本专利技术的第一个技术目的是提供用于检测副猪嗜血杆菌的特异性引物，其核苷酸序列分别：外引物F3：TAATCGGTGATAGCATTGGTC(SEQIDNO：1)；外引物B3：CACCTAACATGAATTGATGAGC(SEQIDNO：2)；内引物FIP：GCAACATTATAGTTAGCACCTAACGGCATCTTCTGATTCAGCAATT(SEQIDNO：3)；内引物BIP：TTGATGGTGGTCATGGTGTTGTAATTCCATACACGCCAGATT(SEQIDNO：4)；环引物LF：CCTTCAATGCCTGTATAGGTATAGT(SEQIDNO：5)；环引物LB：TGACTTCGTAAGAACTGGTGC(SEQIDNO：6)；优选地，扩增反应时，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，与外引物F3和B3的摩尔比为8：4：1。本专利技术提供了上述的特异性引物在制备副猪嗜血杆菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术提供了一种含有上述特异性引物的试剂盒。所述试剂盒优选为微滴数字LAMP绝对定量检测试剂盒。本专利技术的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的检测副猪嗜血杆菌的微滴数字LAMP绝对定量检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1中所述的引物。优选地，基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMPSupermix；(2)无RNA酶的蒸馏水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)细菌总DNA提取试剂。优选地，内引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，环引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，250mmol/LKCl，200mmol/LMgSO4，250mmol/L(NH4)2SO4，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜碱，10mmol/LdNTP，Bst大片断DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNaseCocktail。优选地，阳性对照为副猪嗜血杆菌DNA，阴性对照为超纯水。优选地，细菌总DNA提取试剂包括裂解液A、洗液B、洗液C、洗脱液D、吸附柱和收集管。再有，本专利技术还公开了一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的方法，包括如下步骤：(1)细菌总DNA的提取1)取待检样品1g，加入600μL裂解液A研磨后，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；3)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；4)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；6)将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μL，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板DNA；(2)数字LAMP操作1)待检样品、阴性对照和阳性对照每个反应管各加入数字LAMP反应液19μL；分别取1μL模板DNA，加入相应的反应管中，配置成20μL数字LAMP反应体系；所述模板DNA包括待检样品、阴性对照和阳性对照；2)将20μL样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；3)将微滴转入PCR板中，放入水浴锅或PCR仪中进行扩增；4)将扩增完成的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；5)结果判定及描述：阳性对照：40±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。优选地，数字LAMP反应体系为20μL反应体系，其含有2×ddLAMPSupermix10μL，超纯水9μL，加入1μL模板后为20μL。优选地，扩增程序为：63℃反应35min，并在80℃持续2min。本专利技术以LAMP和数字PCR微滴生成系统及检测系统为依托，开发数字LAMP技术绝对定量检测副猪嗜血杆菌的试剂盒及检测方法。目前尚未有将微滴数字LAMP技术应用于检测副猪嗜血杆菌的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现副猪嗜血杆菌的快速、精准定量，为副猪嗜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物，包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：TAATCGGTGATAGCATTGGTC外引物B3：CACCTAACATGAATTGATGAGC内引物FIP：GCAACATTATAGTTAGCACCTAACGGCATCTTCTGATTCAGCAATT内引物BIP：TTGATGGTGGTCATGGTGTTGTAATTCCATACACGCCAGATT环引物LF：CCTTCAATGCCTGTATAGGTATAGT环引物LB：TGACTTCGTAAGAACTGGTGC。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物，包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：TAATCGGTGATAGCATTGGTC外引物B3：CACCTAACATGAATTGATGAGC内引物FIP：GCAACATTATAGTTAGCACCTAACGGCATCTTCTGATTCAGCAATT内引物BIP：TTGATGGTGGTCATGGTGTTGTAATTCCATACACGCCAGATT环引物LF：CCTTCAATGCCTGTATAGGTATAGT环引物LB：TGACTTCGTAAGAACTGGTGC。2.如权利要求1所述的基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的引物，其特征在于：扩增反应时，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB和外引物F3和B3的摩尔比为8：4：1。3.一种基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物。4.如权利要求3所述的基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMPSupermix；(2)无RNA酶的超纯水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)细菌总DNA提取试剂。5.如权利要求4所述的基于数字LAMP技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于：所述2×ddLAMPSupermix包含以下试剂：内引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，环引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，250mmol/LKCl，200mmol/LMgSO4，250mmol/L(NH4)2SO4，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜碱，10mmol/LdNTP，Bst大片断DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNaseCocktail。6.如权利要求4所述的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽丽，孟赫诚，温雯，石磊，陈洵，刘雨琦，
申请(专利权)人：暨南大学，华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44