猪肺炎支原体培养基及制备方法和其在疫苗中的应用技术

为了解决目前市场上缺乏高效分离和培养猪肺炎支原体的培养基，相关疫苗生产成本高等技术问题，本发明专利技术旨在提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，以及探究了其在制备相关猪肺炎支原体疫苗生产中的应用。本发明专利技术的猪肺炎支原体培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到10

【技术实现步骤摘要】
猪肺炎支原体培养基及制备方法和其在疫苗中的应用
:本专利技术涉及生物
，具体涉及猪肺炎支原体培养基及制备方法和其在疫苗中的应用。
技术介绍
:近年来，随着经济的不断发展，养殖业的发展也不断随之进步。对于生猪的养殖业不断产业化、规模化、科学化。生猪的饲养条件有了明显的、大幅度的改善。对于一些烈性传染病的防控已得到人们充分的认识，但对猪支原体病的认识及防控还未能引起广泛的关注。猪支原体病（MycoplasmalDiseases）是兽医学临床上一种常见的、危害极大的疾病。猪支原体病主要为由猪肺炎支原体等引发的，以呼吸系统疾病为主的猪支原体肺炎；以及以猪滑液支原体等引发的以关节病为主的猪滑液囊支原体病。早在20世纪60年代美国科学家Mare和Switzer就从患猪支原体肺炎的病猪中提取分离出了猪肺炎支原体。2001年美国国家动物健康检测部门对全国养殖猪群做了调查，在万头猪场，52.7％架子猪和68％育肥猪感染过支原体相关疾病，超过其中50％的疾病被诊断为猪支原体肺炎。猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎，我国俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，可造成带菌病猪生长发育缓慢、生长率降低、饲料转化率降低以及饲料和人力的浪费。此外，猪肺炎支原体能够引起机体免疫抑制，致使其他疫苗免疫失败。根据初步统计，该病阳性感染率大概为70％-90％，发病率至少40％以上。患猪生长不良，饲料转化率降低13.8％，生产率下降15.9％，极大增加养猪成本，使经济收入下降，估计我国每年由此病损失可达100亿元以上。此外，MPS的病死率虽不高，但其引发的继发性感染可出现严重死亡，造成的经济损失巨大。规模化猪场中MPS常和数种细菌、病毒等病原协同作用，而引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)严重制约着养猪业的发展。长期以来，该病被认为是威胁全球养猪业的主要传染病之一。然而，我国猪肺炎支原体的分离培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。现有的培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年报道的Friis培养基、1975年江苏农科院专利技术的KM2培养基、《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二000年版)中提出的猪肺炎支原体培养基和2006年农业行业标准中提到的A26培养基。随着技术的发展，专利文献中也报道了多种猪肺炎支原体培养基，例如专利技术专利申请CN201210318816.X公开了一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基，包括(1)基础培养基（2）辅助培养基，主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，该培养基能够既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本专利技术方法制备的半成品菌液效价高达109CCU/ml;同时该培养基采用降低猪血清培养猪肺炎支原体，减轻了猪血清对猪体的过敏应激反应，既考虑到动物的生物安全，又提高了抗原效价，而且降低了生产成本。专利技术专利申请CN201510042434.2公开了一种培养猪肺炎支原体培养基，是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整pH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×109-10CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日。专利技术专利申请CN201710123741.2公开了一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank’s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌，大大地减少了过滤除菌带来的污染风险；辅助培养基由猪血清、精氨酸、半胱氨酸、酚红溶液、青霉素等组成，猪血清通过钴照射除菌，其余成分过滤除菌后与灭活的猪血清混合。所述培养基培养猪肺炎支原体兔化弱毒株的滴度达到109-1010CCU，培养时间最低可至40h，大大减少了陈旧菌、老龄菌的产生，并且猪血清用量可以低至8％，减少了猪血清带来的过敏应激反应，降低了企业生产成本。然而，尽管专利报道资料很多，但市场上仍未出现相关的培养基产品。基于以上技术问题的存在，本专利技术人开展了猪肺炎支原体培养基的优化研究。
技术实现思路
：为了解决目前市场上缺乏高效分离和培养猪肺炎支原体的培养基，相关疫苗生产成本高等技术问题，本专利技术旨在提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，以及探究了其在制备相关猪肺炎支原体疫苗生产中的应用。本专利技术的猪肺炎支原体培养基能够快速分离和培养猪肺炎支原体，培养猪肺炎支原体的滴度可以达到1010-1011CCU，培养时间最低可至42h，减少了陈旧菌和老龄菌的产生，能够获得更高的疫苗免疫原性。为了解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s25-35mL、PPLO肉汤粉2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水850-900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和灭活的健康猪血清70-90mL组成。优选的，所述基础培养基由20×Hank’s30mL、PPLO肉汤粉2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水870ml组成。所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。优选的，所述基础培养基由20×Hank’s35mL、PPLO肉汤粉3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水850mL组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4mL、5％半胱氨酸溶液3mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι5mL、10万U/ml青霉素7mL和灭活的健康猪血清70mL组成。优选的，所述基础培养基由20×Hank’s25mL、PPLO肉汤粉2g、酵母提取物5g、乳清蛋白水解物0.5g、脑心浸液粉5g、1%氯化锌溶液0.5mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水880ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3mL、5％半胱氨酸溶液2mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι2mL、10万U/ml青霉素5mL和灭活的健康猪血清90mL组成。本专利技术还请求保护所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述方法包括如下步骤：第一，基础培养基的配制：按配比量取20×Hank’s25-35mL、PPLO肉汤粉2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水850-900ml，搅拌均匀，10MNaOH调pH至7.2-7.4，120℃高压灭菌15min，冷却至室温；第二，辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液3-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s 25‑35mL、PPLO肉汤粉 2‑3g、酵母提取物2‑5g、乳清蛋白水解物0.5‑3g、脑心浸液粉3‑5g、1%氯化锌溶液0.5‑1mL、0.25% 酚红溶液10 mL和去离子水850‑900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3‑4mL、5％半胱氨酸溶液2‑3mL、1%牛磺酸溶液1‑2mL，5％辅酶Ι1‑5mL、10万U/ml青霉素5‑10mL和灭活的健康猪血清70‑90mL组成。

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中，所述基础培养基由20×Hank’s25-35mL、PPLO肉汤粉2-3g、酵母提取物2-5g、乳清蛋白水解物0.5-3g、脑心浸液粉3-5g、1%氯化锌溶液0.5-1mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水850-900ml组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液3-4mL、5％半胱氨酸溶液2-3mL、1%牛磺酸溶液1-2mL，5％辅酶Ι1-5mL、10万U/ml青霉素5-10mL和灭活的健康猪血清70-90mL组成。2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述基础培养基由20×Hank’s30mL、PPLO肉汤粉2.5g、酵母提取物3g、乳清蛋白水解物2g、脑心浸液粉4g、1%氯化锌溶液0.75mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水870ml组成；所述辅助培养基由5％精氨酸溶液3.5mL、5％半胱氨酸溶液2.5mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι3mL、10万U/ml青霉素8mL和灭活的健康猪血清75mL组成。3.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述基础培养基由20×Hank’s35mL、PPLO肉汤粉3g、酵母提取物2g、乳清蛋白水解物3g、脑心浸液粉3g、1%氯化锌溶液1mL、0.25%酚红溶液10mL和去离子水850mL组成，辅助培养基由5％精氨酸溶液4mL、5％半胱氨酸溶液3mL、1%牛磺酸溶液1mL，5％辅酶Ι5mL、10万U/ml青霉素7mL和灭活的健康猪血清70mL组成。4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永红，崔德凤，薛振华，侯佳佳，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11