可扩展的重组酶级联制造技术

本文中提供了包含基因扰动盒的遗传构建体和使用其来评估基因表达之时机和顺序的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可扩展的重组酶级联相关申请本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2016年4月26日提交的美国临时申请号62/327,479的权益，其通过引用整体并入本文。
本专利技术涉及用于依次、多重且可扩展的基因扰动(genticperturbation)的方法和遗传构建体。
技术介绍
由于有限数量的诱导型系统和诱导物分子，包含诱导型组件的常规遗传工具的复杂性受到限制。此外，这样的工具仅提供基因调节的有限视角，并且缺乏对基因调节的时空动态以及这如何转换为细胞中生物功能的理解。专利技术概述本专利技术的一些方面提供了包含多个基因扰动盒的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒包含：第一类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第一核酸：重组酶活性由第一诱导物诱导的第一诱导型重组酶、第一基因元件、第一终止子，以及在第一重组酶、第一基因元件和第一终止子侧翼的第一对重组酶识别位点，其中第一重组酶能够在第一对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第一核酸结合并对其进行切割；以及第二类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第二核酸：重组酶活性由第二诱导物诱导的第二诱导型重组酶、第二基因元件、第二终止子，以及在第二重组酶、第二基因元件和第二终止子侧翼的第二对重组酶识别位点，其中第二重组酶能够在第二对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第二核酸结合并对其进行切割。在一些实施方案中，所述多个基因扰动盒包含与一个或更多个第二类型的基因扰动盒交替的一个或更多个第一类型的基因扰动盒。在一些实施方案中，遗传构建体还包含第三类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第三核酸：重组酶活性由第三诱导物诱导的第三诱导型重组酶、第三基因元件、第三终止子，以及在第三重组酶、第三基因元件和第三终止子侧翼的第三对重组酶识别位点，其中第三重组酶能够在第三对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第三核酸结合并对其进行切割。在一些实施方案中，遗传构建体还包含位于第一类型的基因扰动盒上游的启动子。在一些实施方案中，启动子是细胞特异性启动子或细胞状态特异性启动子。在一些实施方案中，编码第一基因元件的核酸位于编码第一诱导型重组酶的核酸的3’非翻译区内和/或编码第二基因元件的核酸位于编码第二诱导型重组酶的核酸的3’非翻译区内。在一些实施方案中，编码第一基因元件的核酸位于编码第一诱导型重组酶的核酸的内含子内和/或编码第二基因元件的核酸位于编码第二诱导型重组酶的核酸的内含子内。在一些实施方案中，基因元件是编码蛋白质的核酸、RNA、gRNA、miRNA或shRNA。在一些实施方案中，第一诱导型重组酶和/或第二诱导型重组酶是酪氨酸重组酶。在一些实施方案中，第一诱导型重组酶和/或第二诱导型重组酶是丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，第一诱导型重组酶和/或第二诱导型重组酶是断裂重组酶(splitrecombinase)。在一些实施方案中，断裂重组酶包含该断裂重组酶的第一部分和第二部分。在一些实施方案中，多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个核酶序列。在一些实施方案中，多个基因扰动盒中的每个基因扰动盒包含一个或更多个核酶序列。在一些实施方案中，多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个核糖核酸酶识别序列。在一些实施方案中，多个基因扰动盒中的每个基因扰动盒包含一个或更多个核糖核酸酶识别序列。在一些实施方案中，所述一个或更多个核糖核酸酶识别序列是Cas6/Csy4识别序列。在一些实施方案中，多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个自切割肽序列。在一些实施方案中，所述一个或更多个自切割肽序列是P2A序列。在一些实施方案中，任何诱导物是小分子诱导物。在一些实施方案中，小分子诱导物是激素。在一些实施方案中，激素是赤霉素(gibberellin，GIB)或脱落酸(abscisicacid，ABA)。在一些实施方案中，小分子诱导物是抗生素。在一些实施方案中，抗生素是甲氧苄啶(trimethoprim)。在一些实施方案中，小分子诱导物是合成配体。在一些实施方案中，合成配体是4-羟基他莫昔芬或Shield-1配体。本专利技术的一些方面提供了包含本文中所述的任何遗传构建体的载体。本专利技术的另一些方面提供了重组细胞，其包含本文中所述的任何遗传构建体或含有本文中所述的任何遗传构建体的载体。在一些实施方案中，重组细胞还包含Cas6/Csy4核糖核酸酶。在一些实施方案中，重组细胞还包含Cas9内切核酸酶。在一些实施方案中，重组细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，重组细胞是干细胞。在一些实施方案中，干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPS)。本文中还提供了包含本文中所述的任何重组细胞的转基因生物。在一些实施方案中，转基因生物是转基因非人生物。本专利技术的另一些方面提供了用于评估细胞中基因表达的方法，其包括：(i)向细胞提供包含多个基因扰动盒的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒包含：(a)第一类型的基因扰动盒，其包含编码以下的核酸：重组酶活性由第一诱导物诱导的第一诱导型重组酶、第一基因元件、第一终止子，以及在第一重组酶、第一基因元件和第一终止子侧翼的第一对重组酶识别位点，其中第一重组酶能够在第一对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第一核酸结合并对其进行切割；以及(b)第二类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第二核酸：重组酶活性由第二诱导物诱导的第二诱导型重组酶、第二基因元件、第二终止子，以及在第二重组酶、第二基因元件和第二终止子侧翼的第二对重组酶识别位点，其中第二重组酶能够在第二对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第二核酸结合并对其进行切割；(ii)在其中第一基因扰动盒被表达并且基因元件从核酸上切割的条件下孵育(i)的细胞；以及(iii)评估基因元件的一个或更多个靶标的输出。在一些实施方案中，多个基因扰动盒还包含第三类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第三核酸：重组酶活性由第三诱导物诱导的第三诱导型重组酶、第三基因元件、第三终止子，以及在第三重组酶、第三基因元件和第三终止子侧翼的第三对重组酶识别位点，其中第三重组酶能够在第三对重组识别位点的每个重组酶识别位点与第三核酸结合并对其进行切割。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三基因元件的一个或更多个靶标的输出包括评估所述一个或更多个靶标的表达。参照本专利技术的附图和详细描述，本专利技术的这些及其他方面及其多个实施方案将变得更加明显。本专利技术的每项限制可涵盖本专利技术的多个实施方案。因此，预期涉及任意一个元件或元件组合的本专利技术的每项限制可被包括在本专利技术的每个方面中。本专利技术的应用不限于以下描述中阐述的或附图中举例说明的组件的构造和布置的细节。本专利技术能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实施或进行。附图简述附图不旨在按比例绘制。为清楚起见，并非每个组件在每个附图中都会标记。在附图中：图1A至1C示出了用于依次、多重且可扩展的原位基因扰动的示例性在时空上受调节的级联的示意图。图1A示出了在时空上受调节的级联，其包括细胞类型特异性启动子(P特异性)和三个基因扰动盒(GeneticPerturbationCassette，GPC)，每个基因扰动盒由以下组成：诱导型重组酶(rec本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.遗传构建体，其包含：多个基因扰动盒，其中所述多个基因扰动盒包含：(a)第一类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第一核酸：重组酶活性由第一诱导物诱导的第一诱导型重组酶，第一基因元件，第一终止子，以及在所述重组酶、所述第一基因元件和所述第一终止子侧翼的第一对重组酶识别位点，其中所述第一重组酶能够在该第一对重组识别位点的每个重组酶识别位点与所述第一核酸结合并对其进行切割；以及(b)第二类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第二核酸：重组酶活性由第二诱导物诱导的第二诱导型重组酶，第二基因元件，第二终止子，以及在所述第二重组酶、所述第二基因元件和所述第二终止子侧翼的第二对重组酶识别位点，其中所述第二重组酶能够在该第二对重组识别位点的每个重组酶识别位点与所述第二核酸结合并对其进行切割。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.26 US 62/327,4791.遗传构建体，其包含：多个基因扰动盒，其中所述多个基因扰动盒包含：(a)第一类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第一核酸：重组酶活性由第一诱导物诱导的第一诱导型重组酶，第一基因元件，第一终止子，以及在所述重组酶、所述第一基因元件和所述第一终止子侧翼的第一对重组酶识别位点，其中所述第一重组酶能够在该第一对重组识别位点的每个重组酶识别位点与所述第一核酸结合并对其进行切割；以及(b)第二类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第二核酸：重组酶活性由第二诱导物诱导的第二诱导型重组酶，第二基因元件，第二终止子，以及在所述第二重组酶、所述第二基因元件和所述第二终止子侧翼的第二对重组酶识别位点，其中所述第二重组酶能够在该第二对重组识别位点的每个重组酶识别位点与所述第二核酸结合并对其进行切割。2.权利要求1所述的遗传构建体，其还包含位于所述第一类型的基因扰动盒上游的启动子。3.权利要求1或2所述的遗传构建体，其中编码所述第一基因元件的核酸位于编码所述第一诱导型重组酶的核酸的3’非翻译区内，和/或编码所述第二基因元件的核酸位于编码所述第二诱导型重组酶的核酸的3’非翻译区内。4.权利要求1或2所述的遗传构建体，其中编码所述第一基因元件的核酸位于编码所述第一诱导型重组酶的核酸的内含子内，和/或编码所述第二基因元件的核酸位于编码所述第二诱导型重组酶的核酸的内含子内。5.权利要求1至4中任一项所述的遗传构建体，其中所述基因元件是编码蛋白质的核酸、gRNA、miRNA或shRNA。6.权利要求1至5中任一项所述的遗传构建体，其中所述第一诱导型重组酶和/或所述第二诱导型重组酶是酪氨酸重组酶。7.权利要求1至5中任一项所述的遗传构建体，其中所述第一诱导型重组酶和/或所述第二诱导型重组酶是丝氨酸重组酶。8.权利要求1至5中任一项所述的遗传构建体，其中所述第一诱导型重组酶和/或所述第二诱导型重组酶是断裂重组酶。9.权利要求8所述的遗传构建体，其中所述断裂重组酶包含所述断裂重组酶的第一部分和第二部分。10.权利要求1至9中任一项所述的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个核酶序列。11.权利要求1至10中任一项所述的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个核糖核酸酶识别序列。12.权利要求11所述的遗传构建体，其中所述一个或更多个核糖核酸酶识别序列是Cas6/Csy4识别序列。13.权利要求1至12中任一项所述的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒中的一个或更多个基因扰动盒包含一个或更多个自切割肽序列。14.权利要求13所述的遗传构建体，其中所述一个或更多个自切割肽序列是P2A序列。15.权利要求1至14中任一项所述的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒包含与一个或更多个所述第二类型的基因扰动盒交替的一个或更多个所述第一类型的基因扰动盒。16.权利要求1至15中任一项所述的遗传构建体，其中所述多个基因扰动盒还包含(c)第三类型的基因扰动盒，其包含编码以下的第三核酸：重组酶活性由第三诱导物诱导的第三诱导型重组酶，第三基因元件，第三终止子，以及在所述重组酶、所述第三基因元件和所述第三...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢冠达，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国,US