纤维二糖水解酶变体和编码其的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有增加的热活性或热稳定性的纤维二糖水解酶变体，编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纤维二糖水解酶变体和编码其的多核苷酸对序列表的引用本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景
本专利技术涉及纤维二糖水解酶变体、编码这些变体的多核苷酸以及产生和使用这些变体的方法。
技术介绍
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1,4-连接的二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的需要、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业废弃物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木质纤维素转化成可发酵糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵糖就可以容易地被酵母发酵成乙醇。WO2011/050037披露了具有改进的热稳定性的土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶变体。WO2011/050037披露了具有改进的热稳定性的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)纤维二糖水解酶变体。WO2005/028636披露了红褐肉座菌(Hypocreajecorina)Cel7A纤维二糖水解酶I的变体。WO2005/001065披露了灰腐质霉(Humicolagrisea)Cel7A纤维二糖水解酶I、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)纤维二糖水解酶I、和嗜热革节孢(Scytalidiumthermophilium)纤维二糖水解酶I的变体。WO2004/016760披露了红褐肉座菌(Hypocreajecorina)Cel7A纤维二糖水解酶I的变体。美国专利号7,375,197披露了里氏木霉纤维二糖水解酶I的变体。本领域需要具有改进的特性的纤维二糖水解酶变体以增加木质纤维素原料的糖化效率。
技术实现思路
本专利技术涉及分离的纤维二糖水解酶变体，这些变体包括与SEQIDNO:1的位置8、17、113、157、159、184、199、240、250、274、318、325、328、347、349、358、360、380、391、393、394、412以及430相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维二糖水解酶活性。本专利技术还涉及纤维二糖水解酶变体，这些变体包含变体催化结构域，其中变体催化结构域包含在与SEQIDNO:1的位置8、17、113、157、159、184、199、240、250、274、318、325、328、347、349、358、360、380、391、393、394、412以及430相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中纤维二糖水解酶变体具有纤维二糖水解酶活性。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及降解纤维素材料的方法，这些方法包括：用包含本专利技术的纤维二糖水解酶变体的酶组合物处理纤维素材料。在一方面，这些方法进一步包含回收该降解的纤维素材料。本专利技术还涉及产生发酵产物的方法，这些方法包括：(a)用包含本专利技术的纤维二糖水解酶变体的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵这一糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；以及(c)从该发酵中回收该发酵产物。本专利技术还涉及发酵纤维素材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中该纤维素材料是用包含本专利技术的纤维二糖水解酶变体的酶组合物糖化的。在一方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一方面，这些方法进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。附图说明图1A和1B示出了Penicilliumvasconiae纤维二糖水解酶(SEQIDNO:1)、里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶(SEQIDNO:2)、埃默森青霉菌(Penicilliumemersonii)纤维二糖水解酶(SEQIDNO:3)、奥斯塔尼青霉(Penicilliumoccitanis)纤维二糖水解酶(SEQIDNO:4)、雷塞氏篮状菌(Talaromycesleycettanus)纤维二糖水解酶(SEQIDNO:5)、以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)纤维二糖水解酶(SEQIDNO:6)。定义乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基基团从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和对硝基苯乙酸酯(p-nitrophenylacetate)的水解。可以在含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物来确定乙酰木聚糖酯酶活性。将一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在pH5、25℃下每分钟能够释放1微摩尔对硝基酚根阴离子的酶的量。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mM乙酸钠(pH5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(MegazymeInternationalIreland,Ltd.)、布瑞公司，威克洛郡，爱尔兰)以总体积200μl在40℃处持续30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司(Bio-RadLaboratories,Inc.))进行阿拉伯糖分析来确定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指可催化α-D-葡萄糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)。可以根据deVries，1998，J.Bacteriol.[细菌学杂志]180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量。辅助活性9多肽：该术语“辅助活性9多肽”或“AA9多肽”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(lyticpolysaccharidemonooxygenase)(Quinlan等人，2011，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]108:15079-15084；Philli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纤维二糖水解酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:1的位置8、17、113、157、159、184、199、240、250、274、318、325、328、347、349、358、360、380、391、393、394、412、以及430相对应的一个或多个位置处包括取代，其中该变体具有纤维二糖水解酶活性并且其中该变体与亲本纤维二糖水解酶具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.24 US 62/312,8061.一种纤维二糖水解酶变体，该变体在对应于SEQIDNO:1的位置8、17、113、157、159、184、199、240、250、274、318、325、328、347、349、358、360、380、391、393、394、412、以及430相对应的一个或多个位置处包括取代，其中该变体具有纤维二糖水解酶活性并且其中该变体与亲本纤维二糖水解酶具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。2.如权利要求1所述的纤维二糖水解酶变体，其中该亲本纤维二糖水解酶与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。3.如权利要求1所述的纤维二糖水解酶变体，其中该亲本纤维二糖水解酶是SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6的片段，其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。4.如权利要求1-3中任一项所述的纤维二糖水解酶变体，该变体与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6的多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。5.一种纤维二糖水解酶变体，该变体包含变体催化结构域，其中该变体催化结构域包含在与SEQIDNO:1的位置8、17、113、157、159、184、199、240、250、274、318、325、328、347、349、358、360、380、391、393、394、412、以及430相对应的一个或多个位置处的取代，并且该变体催化结构域与亲本纤维二糖水解酶的催化结构域具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。6.如权利要求5所述的纤维二糖水解酶变体，其中该亲本纤维二糖水解酶的催化结构域与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、或SEQIDNO:6的催化结构域具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。7.如权利要求5或6所述的纤维二糖水解酶变体，该变体进一步包含碳水化合物结合模块(例如，外源的碳水化合物结合模块)。8.如权利要求1-7中任一项所述的纤维二糖水解酶变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：T8A,P；S17Q；N113D；K157R；S159P；D184N；V199P；E240G；S250D；F274Y；G318A,P,S；T325P；T328P；T347P；D349V；G358A；G360S,T；D380N；N391D；S393D；S394P；T412A；以及T430V。9.如权利要求1-8中任一项所述的纤维二糖水解酶变体，该变体进一步包含在与SEQIDNO:1的位置4、21、26、38、39、44、45、46、51、52、53、54、72、75、87、93、94、95、100、102、108、111、114、129、130、131、137、138、139、144、150、156、157、183、184、187、194、195、196、197、198、199、200、201、205、206、209、211、219、237、241、247、253、260、264、271、280、320、322、330、332、343、345、350、357、...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·沃古利斯，L·迪马斯，D·奥斯本，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK