虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物技术

本发明专利技术涉及一种虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物。该虾夷扇贝内脏多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，‑SO4存在于Man(1→的C‑4和/或→3Gal(1→的C‑4位。该多糖具有抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的活性作用，能延长活化部分凝血酶原时间APTT和凝血酶时间TT，对凝血酶原时间PT无显著影响。

【技术实现步骤摘要】
虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物
本专利技术总地涉及活性多糖
，具体涉及虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物。
技术介绍
虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)，主要产自我国的辽宁省及山东省的沿海地区。随着扇贝加工业的不断发展，加工产生的副产物的量也在不断增加。扇贝内脏是扇贝加工的副产物，包括扇贝的消化道，消化腺，性腺，肾和循环系统，约占去壳后扇贝总体重的30％。目前这些扇贝内脏通常被丢弃，不仅造成环境的污染，也是生物资源的浪费。因此，开发利用扇贝内脏具有重要意义。已有研究报道扇贝内脏中具有活性多糖成分。王长云从海湾扇贝裙边中提取分离精制得到一种结构类似于肝素的多糖；李珊从栉孔扇贝和海湾扇贝裙边中提取得到一种糖胺聚糖，通过结构分析最终确定这种结构的糖胺聚糖为透明质酸；宋荪阳发现扇贝性腺中的酸性多糖具有抗氧化活性。血栓形成是一个严重的威胁健康问题，也是心脏病发作、中风等诸多危险因素疾病的原因。在过去的几十年里，防止心脑血管的血栓成为备受关注的研究课题。肝素和华法林是目前临床广泛使用的抗凝血的药物，但仍存在很多局限性，比如可能导致严重出血、增加动脉粥样硬化和骨质疏松症风险等。因此，亟需开发新的抗凝血药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种虾夷扇贝内脏多糖，以虾夷扇贝加工产生的内脏副产物为原料，通过酶解、季铵盐沉淀、色谱分离等过程制备得到一种多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主链结构为→6)Man(1→3)Gal(1→。这种多糖具有抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的活性作用，能延长活化部分凝血酶原时间APTT和凝血酶时间TT，对凝血酶原时间PT无显著影响。本专利技术提供了一种虾夷扇贝内脏多糖，其所述多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，-SO4存在于Man(1→的C-4和/或→3Gal(1→的C-4位。优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖主链的→3)Galp(1→的C-4位被Xly或Glc取代。更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的硫酸基含量为7％-18％，糖醛酸含量为1％-10％。更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的分子量为50kDa-1000kDa，优选为63kDa-630kDa。更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的糖残基结构至少包括Rhap(1→、→4)Arap(1→、→4)Fucp(1→、Fucp(1→、Xylp(1→、→4)Rhap(1→、Manp(1→、Glcp(1→、→2,4)Arap(1→、→3)Fucp(1→、→4)Fucp(1→、→4)Galp(1→、Galp(1→、→3,4)Rhap(1→、→4)Manp(1→、→3)Galp(1→、→6)Manp(1→、→6)Galp(1→和→3,4)Galp(1→中的5种以上，存在己糖-糖醛酸，己糖-己糖和脱氧己糖-己糖重复二糖片段中的一个或多个。或更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的单糖组成包括鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)。前述单糖组成的摩尔比具体为氨基葡萄糖:氨基半乳糖:鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝(1.0-2.4):1.0:(2.2-3.5):(3.0-5.0):(1.7-3.2):(2.5-7.0):(4.5-5.3):(3.1-4.2):(7.6-9.4)。本专利技术还提供了前述多糖的提取方法，其中，所述提取方法包括：(1)将虾夷扇贝内脏干粉于无水乙醇和正己烷1:2体积比混合溶液中搅拌0.5-2小时，静置过夜，除去脂肪，将上层有机试剂去除并风干；(2)向每10g风干的样品中加入5-10mL浓度为0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二钠溶液及25-40mL浓度为0.05mol/L，pH＝8的K2HPO4缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的胰蛋白酶干粉,所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250N.F.U/mg，37℃水浴震荡酶解4h之后加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉,所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，65℃水浴震荡酶解2-4h制得混合溶液；(3)步骤(2)所述混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min,温度4℃，取上清液；(4)向上清液中，对应1g步骤(2)风干的样品加入1.0-2.0mL3-13％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度20℃，取沉淀；(5)每g沉淀溶解于1-2mLNaCl-乙醇混合溶液，该混合溶液为2.5-3.5mol/LNaCl和90-100％乙醇以体积比100:15混合所得溶液，再加入2.5-4mL90-100％乙醇溶液，4℃放置8h以上，离心，转速6000-10000r/min，时间10-30min，取沉淀；(6)每g沉淀用2-5mL80％和95％乙醇洗1-4次后，用水溶解，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；(7)加入0.5-1.5％亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心7-20min，转速8000-12000r/min脱除蛋白，将上清液冻干得到虾夷扇贝内脏粗糖；(8)虾夷扇贝内脏粗糖加样于0.25MNaCl平衡过的DEAE-纤维素柱，依次用0.25-0.75MNaCl溶液洗脱1-4个柱体积，优选为依次用0.25、0.5MNaCl溶液洗脱1-2个柱体积，收集洗脱部分，冻干；(9)将步骤(8)所述冻干样品采用SephadexG-100凝胶柱进行分离，用0.1-0.2MNaCl作为洗脱液，收集得到虾夷扇贝内脏多糖。优选地，根据前述的提取方法，其中，步骤(1)中的虾夷扇贝内脏包括虾夷扇贝的消化道，消化腺，性腺，肾和循环系统中的一种或多种。本专利技术还提供了前述多糖在制备抗凝血药物中的应用。本专利技术还提供了一种药物组合物，其中，包含前述多糖。通过检测抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的作用、活化凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)评估了本专利技术虾夷扇贝内脏多糖的抗凝血效果。浓度大于0.1mg/mL的虾夷扇贝内脏多糖会对凝血酶催化凝血纤维蛋白原具有明显的抑制作用，且抑制率与剂量正相关，浓度为1mg/mL时，抑制率为50％-100％。虾夷扇贝内脏多糖可以延长APTT，在浓度为200μg/mL时APTT为45-80s，在浓度为2000μg/mL时APTT超过200s。虾夷扇贝内脏多糖对PT没用延长作用，说明虾夷扇贝酸性多糖不能抑制外源性途径凝血。虾夷扇贝内脏多糖对TT有较弱的延长作用，在浓度为2000μg/mL时，TT为40-50s。以上结果也说明虾夷扇贝酸性多糖抗凝血的机制是抑制内源性和/或共同途径凝血和凝血酶活性或纤维蛋白原转化为纤维蛋白。附图说明图1为实施例1中SVP2-2的单糖组成分析；图2为实施例1中SVP2-2的二糖片段分析；图3为实施例2中SVP2-2对纤维蛋白原凝血的抑制作用；图4为实施例3中SVP2-1单糖组成分析；图5为实施例3中SVP2-1二糖片段分析；图6为实施例4中SVP2-1对纤维蛋白原凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虾夷扇贝内脏多糖，其特征在于，所述多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，‑SO4存在于Man(1→的C‑4和/或→3Gal(1→的C‑4位。

【技术特征摘要】
1.一种虾夷扇贝内脏多糖，其特征在于，所述多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，-SO4存在于Man(1→的C-4和/或→3Gal(1→的C-4位。2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于，所述多糖主链的→3)Galp(1→的C-4位被Xly或Glc取代。3.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的硫酸基含量为7％-18％，糖醛酸含量为1％-10％。4.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的分子量为50kDa-1000kDa，优选为63kDa-630kDa。5.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的糖残基结构至少包括Rhap(1→、→4)Arap(1→、→4)Fucp(1→、Fucp(1→、Xylp(1→、→4)Rhap(1→、Manp(1→、Glcp(1→、→2,4)Arap(1→、→3)Fucp(1→、→4)Fucp(1→、→4)Galp(1→、Galp(1→、→3,4)Rhap(1→、→4)Manp(1→、→3)Galp(1→、→6)Manp(1→、→6)Galp(1→和→3,4)Galp(1→中的5种以上，存在己糖-糖醛酸，己糖-己糖和脱氧己糖-己糖重复二糖片段中的一个或多个。6.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的单糖组成包括鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。7.权利要求1所述多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：(1)将虾夷扇贝内脏干粉于无水乙醇和正己烷1:2体积比混合溶液中搅拌0.5-2小时，静置过夜，除去脂肪，将上层有机试剂去除并风干；(2)向每10g风干的样品中加入5-10mL浓度为0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二钠溶液及25-40mL浓度为0.05mol/L，pH＝8的K2HPO4缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的胰蛋白酶干粉,所述胰蛋白酶干粉的酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，王立龙，于奇，艾春青，温成荣，王琳琳，曹春阳，李凌霄，韩非，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21