辨识与鉴别来自栽培种苹果的尿苷二磷酸葡萄糖：根皮素的4’-O-葡萄糖基转移酶的方法技术

本发明专利技术公开一种产生三叶苷的方法。所述方法包括：在允许形成三叶苷的条件下使包含与SEQ ID NO：8至少90％相同并具有4'‑O‑葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的多肽与根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖进行接触，从而产生三叶苷。并公开了一种制备产生三叶苷的一植物的方法、基因转殖植物或植物细胞以及产生基因转殖植物的方法。还公开了包含三叶苷的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】辨识与鉴别来自栽培种苹果的尿苷二磷酸葡萄糖：根皮素的4’-O-葡萄糖基转移酶的方法
与
技术介绍
在本专利技术的一些实施例中，本专利技术涉及A’-O-糖基转移酶，更具体地但不限于，涉及其用于生产三叶苷和用于改造具有增加的三叶苷含量的细胞和植物的用途。苹果(MalusxdomesticaBorkh)是一种农业和经济上重要的食品和饮料来源。苹果积累了高含量的多种酚类抗氧化剂，包括类黄酮和联苯植物抗毒素，其含量可能取决于许多因素，如基因型、发育阶段或生物刺激。在常见的苯丙烷类衍生物中，苹果的特征在于存在二氢查耳酮(DHCs)，这种结构与常见的类黄酮前体密切相关，即查耳酮。与其他类黄酮一样，DHCs表现出多种羟基和葡萄糖基取代模式。3-OH-根皮素、根皮苷(根皮素-2’-O-葡萄糖苷)(图4中的第7号说明)、三叶苷(根皮素-4’-O-葡萄糖苷)(图1和4中的第6号说明)和三羟基根皮素糖苷化衍生物(3-羟基卟啉-4’-O-葡萄糖苷)在苹果植物的茎、叶、花和果实中以不同的组合积累。DHCs在植物中的生理功能仍未得到解决。他们被认为可以作为叶子中的紫外线过滤剂，或者起到作为有效的抗氧化剂和抗病原体的作用，但仍然缺乏确凿的证据。例如根皮素-在植物界中发现的一种简单的二氢查耳酮，(图1和4中的第5号说明)具有对葡萄糖共同运输蛋白1的抑制活性和已证实的抗氧化活性。据报导，DHCs具有抗癌活性，抑制心血管疾病或成为阿兹海默症的潜在药物。尽管它们作为药物和食品添加剂具有很高的潜力，但由于不具水溶性和低生物利用度，DHCs的使用仍然有限，其部分可通过糖基化来改善。在根皮素的4’-位置的葡萄糖基化(图1和4中的第5号说明)产生甜味化合物，三叶苷(图1和4中的第6号说明)，也称为修饰的二氢查耳酮。先前已在多穗石栎(Lithocarpuspolystachyus)的葡萄属(Vitis)物种的叶子中检测到三叶苷，并且还存在于不同的苹果属物种中，包括苹果树(M.domestica)和裂叶桑(M.trilobata)。其他二氢查耳酮衍生物也是甜味的，新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC)和柚皮苷二氢查耳酮，后者发现在棘豆中积累，比蔗糖每重量单位甜1000倍，并且在加热和大的pH值范围内稳定。二氢查耳酮还被证明可用作苦味阻滞剂和增味剂，在食品、饮料和制药工业中具有多种用途。总共，从30个植物家族中已知大约200种不同的二氢查耳酮，包括山茶属、草莓属、多穗石栎属、豆科植物和柑橘属植物。达到植物中三叶苷的生物合成途径尚未完全解开。通过查耳酮合成酶催化一分子的4-二氢香豆酰-辅酶A(图1中的第3号说明)和三分子的丙二酰基辅酶A的缩合，得到根皮素(如图1所示)。葡萄糖基团在4’位置与根皮素的连接被认为是形成三叶苷的最后一步。欧诺等人，[欧诺等人，美国国家科学院院刊，美国(2006)103：11075-11080]已经指出，查耳酮的糖基化可以通过从金鱼草(Aelrrhinummajus)分离的重组查耳酮4’-O-葡萄糖基转移酶催化。最近，已显示来自细菌(地衣芽孢杆菌)的功能性表现的UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)催化根皮素转化为三叶苷[佩迪等人，应用及环境微生物学期刊，(2013)79,3516-3521]。美国专利申请号US20110030098公开了通过用编码具有根皮素糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸转化植物细胞或植物来生产具有增加的根皮苷或根皮素糖基转移酶活性的植物细胞或植物的方法。US200110030098还提供了经遗传修饰以包含及/或表现多核苷酸的宿主细胞、植物细胞和植物。
技术实现思路
根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种产生三叶苷的方法，所述方法包括：在允许形成三叶苷的多个条件下，使包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4’-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的一多肽与根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖进行接触，从而产生三叶苷。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种制备产生三叶苷的一植物的方法，所述方法包括：在所述植物中上调包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4’-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的一多肽的表现量，其中所述植物包括根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖，从而制备所述植物。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种基因转殖的植物或植物细胞，包括：编码一多肽的一外源核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4’-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种产生一基因转殖的植物的方法，所述方法包括：向所述植物的一细胞中引入核酸建构体，所述核酸建构体包含编码一多肽的一核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4’-O-糖基转移酶活性的氨基酸序列。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种如本专利技术的一些实施例所述的细胞的细胞裂解物。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种组合物，包括如本专利技术的一些实施例所述的细胞裂解物的三叶苷。根据本专利技术的一些实施例的一目的，提供一种组合物，包括如本专利技术的一些实施例所述的方法所产生的三叶苷。根据本专利技术的一些实施例，所述方法是在体内进行。根据本专利技术的一些实施例，所述体内是在一植物细胞内。根据本专利技术的一些实施例，所述体内是在一微生物内。根据本专利技术的一些实施例，所述微生物选自酵母菌和细菌所组成的群组中。根据本专利技术的一些实施例，所述方法是在体外进行。根据本专利技术的一些实施例，所述体外是一无细胞系统。根据本专利技术的一些实施例，所述方法更包括：纯化所述三叶苷。根据本专利技术的一些实施例，所述上调包括基因工程。根据本专利技术的一些实施例，所述上调包括：与表现所述多肽的一植物杂交，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同的氨基酸序列。根据本专利技术的一些实施例，所述植物细胞包含一受质，所述受质选自下列所组成的群组：根皮素、三叶苷、根皮苷、槲皮素、柚皮素和叶黄素。根据本专利技术的一些实施例，所述植物细胞包含一尿苷二磷酸葡萄糖受质。根据本专利技术的一些实施例，所述植物细胞包含一根皮素受质和一尿苷二磷酸葡萄糖受质。根据本专利技术的一些实施例，当所述基因转殖的植物或植物细胞包含所述根皮素与所述尿苷二磷酸葡萄糖时，所述基因转殖的植物或植物细胞产生三叶苷。根据本专利技术的一些实施例，所述的方法或所述的基因转殖的植物或植物细胞还包括：选择所述细胞或所述植物以表现所述SEQIDNO：8或与所述SEQIDNO：8至少90％相同的所述多肽的产物。根据本专利技术的一些实施例，所述的方法或所述的基因转殖的植物或植物细胞还包括：选择具有A’-O-糖基转移酶活性的所述细胞或所述植物。根据本专利技术的一些实施例，所述的方法或所述的基因转殖的植物或植物细胞还包括：选择产生所述三叶苷的所述细胞或所述植物。根据本专利技术的一些实施例，所述植物细胞选自下列所组成的群组之中：一叶子的一细胞、一花的一细胞、一果实的一细胞。根据本专利技术的一些实施例，所述植物属于蔷薇科。根据本专利技术的一些实施例，所述植物选自下列所组成的群组之中：苹果、海棠、三叶海棠、复叶葡萄、甘葛、多穗石柯、白檀、墨西哥菝葜以及草莓。根据本专利技术的一些实施例，所述的细胞裂解物包括三叶苷。根据本专利技术的一些实施例，所述组合物为一食品、一饲料或一饮料产品。根据本专利技术的一些实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生三叶苷的方法，其特征在于：所述方法包括：在允许形成三叶苷的多个条件下，使包含与SEQ ID NO：8至少90％相同并具有4'‑O‑葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的一多肽与根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖进行接触，从而产生三叶苷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.09 US 62/305,5911.一种产生三叶苷的方法，其特征在于：所述方法包括：在允许形成三叶苷的多个条件下，使包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4'-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的一多肽与根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖进行接触，从而产生三叶苷。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法是在体内进行。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述体内是在一植物细胞内。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述体内是在一微生物内。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述微生物选自酵母菌和细菌所组成的群组中。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法是在体外进行。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述体外是一无细胞系统。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：纯化所述三叶苷。9.一种制备产生三叶苷的一植物的方法，其特征在于：所述方法包括：在所述植物中上调包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有A'-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列的一多肽的表现量，其中所述植物包括根皮素和尿苷二磷酸葡萄糖，从而制备所述植物。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述上调包括基因工程。11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述上调包括：与表现所述多肽的一植物杂交，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同的氨基酸序列。12.一种基因转殖的植物或植物细胞，其特征在于：包括编码一多肽的一外源核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4'-O-葡萄糖基转移酶活性的氨基酸序列。13.一种产生一基因转殖的植物的方法，其特征在于：所述方法包括：向所述植物的一细胞中引入核酸建构体，所述核酸建构体包含编码一多肽的一核酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：8至少90％相同并具有4'-O-糖基转移酶活性的氨基酸序列。14.如权利要求12所述的基因转殖的植物或植物细胞或如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述细胞包含一受质，所述受质选自下列所组成的群组：根皮素、三叶苷、根皮苷、槲皮素、柚皮素和叶黄素。15.如权利要求12或14中任一项所述的基因转殖的植物或植物细胞或如权利要求13或14中任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞包含一尿苷二磷酸葡萄糖受质。16.如权利要求12所述的基因转殖的植物或植物细胞或如权利要求13所述的方法，其特征在于：其中所述细胞包含一根皮素受质和一尿苷二磷酸葡萄糖受质。17.如权利要求16所述的基因转殖的植物或植物细胞或如权利要求16所述的方法，其特征在于：当所述基因转殖的植物或植物细胞包含所述根皮素与所述尿苷二磷酸葡萄糖时，所述基因转殖的植物或植物细胞产生三叶苷。18.如权利要求3至5、8至11或13至17中任一项所述的方法或如权利要求12或14至17中任一项所述的基因转殖的植物或植物细胞，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：姆瓦哈格·艾柏达，
申请(专利权)人：以色列国家农业部，农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心，
类型：发明
国别省市：以色列,IL