一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法技术

本发明专利技术涉及医疗器械领域，尤其涉及人工工程皮肤领域。一种胶原‑丝素蛋白‑壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，该方法包括以下的步骤：1）将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0~4.0%的胶原蛋白水溶液以及1.0~2.0%的丝素蛋白水溶液中；2）将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1~5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；3）将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，‑30~‑20℃预冻成型，然后‑65~‑55℃真空干燥48h~72h，获得的工程皮肤三维支架。该方法制备份工程皮肤三维支架巧妙利用壳聚糖微球包裹黄芪多糖构建缓释系统，并复合在胶原‑丝素蛋白三维支架上，以解决该生物复合材料支架促血管化的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法
本专利技术涉及医疗器械领域，尤其涉及人工工程皮肤领域。
技术介绍
皮肤是面积最大的人体器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着我国经济、社会的快速发展，各种急、慢性致伤因素，如机械损伤、烧伤、体表肿瘤切除、慢性溃疡、交通事故、建筑事故等导致的皮肤缺损在临床上十分常见，常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。大面积皮肤缺损的治疗方法，主要有伤口覆盖物、自体皮肤移植、异体皮肤移植等，但伤口覆盖物没有生理功能，自体皮肤移植取材面积有限，异体皮肤移植免疫排斥反应大、皮肤容易脱落坏死等，易造成对患者的二次损伤，增加患者的痛苦。因此，应用组织工程皮肤修复为解决此问题带来了希望。近二十年来，组织工程学的迅猛发展，为大面积皮肤缺损的重建与修复提供了新的思路和治疗途径。1987年，美国国家科学基金会(NSF)在加利福尼亚举行的生物工程专家讨论会上，首次提出了组织工程的概念，并明确了组织工程的定义：“TissueEngineering”istheapplicationofprinciplesandmethodsofengineeringandlifesciencestowardthefundamentalunderstandingofstructure-functionrelationshipsinnormalandpathologicalmammaliantissuesanddevelopmentofbiologicalsubstitutestorestore，maintain，orimprovetissuefunction。其核心是利用生命科学、材料学、计算机科学和工程学等学科的原理与方法，研究和开发产品替代、修复、改善人体各种组织和器官或使其再生的一门交叉学科。随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。经典意义上的组织工程皮肤包括表皮替代物、真皮替代物和表皮-真皮双层替代物，涉及生物支架材料、种子细胞、体内微环境、生物活性因子和刺激信号等多个方面。理想的皮肤替代物应符合如下4个条件：(1)具有相互连通的三维多孔结构，为细胞的长入、营养物质与代谢产物的转运提供便利；(2)具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且降解速率与新生组织生成速率相匹配；(3)合适的表面化学结构，有利于细胞的黏附、增殖及分化；(4)具有与待植入部位的目标组织相匹配的机械强度。经过几十年的发展，目前已有多个组织工程皮肤产品问世，如ApligrafTM、OrCelTM、IntegraTM等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并应用于临床皮肤缺损的治疗中。然而，结合多年临床应用过程中遇到的问题，经文献检索，我们认为目前组织工程皮肤还面临着许多缺点和不足：1、由于血管生成能力差，易导致移植的皮肤早期没有血管系统供给营养，使皮肤替代物容易发生坏死，致移植失败；2、活性组织工程皮肤中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，甚至出现全身免疫反应等严重并发症，且存在传播疾病的危险；3、目前所有的组织工程皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，如：血管、毛囊、皮脂腺、汗腺等；4、现阶段组织工程皮肤修复常伴有创面感染、不愈合等并发症，成活率低，治疗效果并不理想。究其原因，与创面移植物修复的早期血管化程度密切相关。目前所研究的组织工程皮肤、脱细胞真皮支架等，都不具备血管网结构，本身没有营养来源，植入体内后，需通过诱导周围组织血管长入，使其逐渐与周围组织建立血液循环、获得营养。因此，如何实现快速血管化是目前组织工程皮肤领域面临的重大难题之一。近年来，随着科学技术的不断发展，组织工程皮肤血管化的研究也逐渐深入，并取得了很大的成功。研究表明，通过构建复合材料缓释系统、筛选种子细胞类型、添加有效活性因子、细胞基因修饰等方式，均可促进组织工程皮肤的早期血管化。而复合生物材料以其优越的性能而备受青睐，其中，胶原蛋白(collagen，COL)-丝素蛋白(silkfibroin，SF)材料支架被发现具有很好的亲水性、组织相容性和生物降解性。胶原蛋白，是动物结缔组织的主要结构成分，不同种类动物来源的胶原具有非常相似的化学和生物学特征。胶原蛋白无毒具有较低的免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性，而且来源广泛，是应用最早的天然生物材料，可为细胞的贴壁、生长、增殖和定向分化提供微环境；丝素蛋白，是一种含有人体必需氨基酸的天然蛋白质，具有良好的生物相容性和力学性能，且降解缓慢。丝素蛋白由蚕丝经过脱胶制得，是一种无生理活性的天然高分子纤维蛋白，占蚕丝的70％～80％，含18种氨基酸，其中甘氨酸(Gly)约占46％、丙氨酸(Ala)约占29％、丝氨酸(Ser)约占12％。丝素蛋白由重链(H链，相对分子质量350kD)、轻链(L链，相对分子质量25.8kD)及糖蛋白p25(相对分子质量23.55kD)、3个寡糖链组成。此外，丝素蛋白存在SilkI和SilkII两种不同的构象，SilkI构象包括无规则线团和a-螺旋，SilkII构象则为反平行β-折叠。其中SilkI结构不够稳定，经极性溶剂、热处理等可转变成稳定的SilkII结构。Vepari等与Altman等认为丝素蛋白主要优点如下：1、具有其他天然纤维无法比拟的力学性能和柔性；2、对水和氧通透性好；3、可通过相对简单的处理获得多种不同的形态；4、有利于组织细胞长入，体内、外降解缓慢。基于上述优点，多孔丝素蛋白在皮肤组织工程支架中的应用研究日趋得到发展。因此，在胶原中加入一定比例的丝素蛋白，能有效改善其干态下的机械物理性能，如提高力学和抗水性能、降低热水溶失率、增强其对成纤维细胞、皮肤表皮细胞的黏附性，为细胞提供长久的支持，以更好的地匹配组织细胞的生长速度，而且可经过不同的处理方法达到不同的形态和孔隙要求，增强支架的弹性和多空状结构。作为祖国医学的瑰宝，中医中药在治疗骨伤科、皮肤科疾病方面，活血化瘀法一直被认为是最重要的治法之一。而活血药物促进血管新生的药理作用已被许多学者证实，其广泛应用于缺血性脑卒中、冠心病、骨折等疾病的临床治疗。黄芪是常用中草药，其味甘，性微温，具有益气补虚之功效，可生用，亦可炙用。生用能固表，并能排毒、生肌；炙用能益气补中；其皮可利尿逐水湿，且持续时间较长。是中医补气要药。现代药理研究发现其具有增强免疫系统，抵御疾病、增强体质，抗氧化延缓衰老，改善心功能状态，抗病毒，抗癌等功能。中医认为补气以生血，李杲《内外伤辨惑论》首载该方重用黄芪，认为黄芪能够“大补脾肺之气，以裕生血之源…使阳生阴长，气旺血生”。有学者研究发现证明黄芪具有很强的促血管再生作用，而该作用主要归功于黄芪的有效成分-黄芪多糖(AstragalusPolysacharin，APS)。黄芪多糖对体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞增殖具有促进作用，研究发现APS在低浓度时可明显促进细胞的增殖。中国专利技术专利(公开号：CN10458677本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶原‑丝素蛋白‑壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：1）将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0~4.0%的胶原蛋白水溶液以及1.0~2.0%的丝素蛋白水溶液中；2）将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1~5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；3）将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，‑30~‑20℃预冻成型，然后‑65~‑55℃真空干燥48h~72h，获得的工程皮肤三维支架。

【技术特征摘要】
1.一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：1）将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0~4.0%的胶原蛋白水溶液以及1.0~2.0%的丝素蛋白水溶液中；2）将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1~5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；3）将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，-30~-20℃预冻成型，然后-65~-55℃真空干燥48h~72h，获得的工程皮肤三维支架。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黄芪多糖/壳聚糖微球的制备方法包括以下的步骤：1）将壳聚糖固体，50℃水浴条件下，加至1~5%的冰乙酸溶液中，30~50rpm搅拌，使壳聚糖完全溶解，获得壳聚糖-冰乙酸溶液；2）将黄芪多糖，加至制备好的壳聚糖-乙酸溶液中，搅拌使其完全溶解，获得混合溶液；3）在烧杯中加入含有1~2%体积百分比的Span-80的液体石蜡作为油相，将壳聚糖混合溶液逐滴加入到油相，50℃水浴条件下，30~50rpm搅拌使其乳化，并维持10~30min；4）待乳化结束后，向溶液中加入戊二醛；50℃水浴条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑宣，全仁夫，何丽红，陈利红，瞿钢，许世超，方伟利，胡云根，
申请(专利权)人：杭州市萧山区中医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33