一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒及其应用，其特征在于：它包括：包被有仲丁灵偶联抗原的酶标板、仲丁灵单克隆抗体、酶标记抗抗体、仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。所述仲丁灵偶联抗原是由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述仲丁灵半抗原是由4‑氯‑3,5‑二硝基苯乙酸与丁胺反应得到。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测仲丁灵残留量的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶中仲丁灵的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒及其应用
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒及其应用，其特别适于烟草及烟草制品中仲丁灵残留量的检测。
技术介绍
仲丁灵（Butralin）又名地乐胺、双丁乐灵、硝苯胺灵、比达宁、止芽素，化学名称为N-仲丁基-4-特丁基-2,6-二硝基苯胺，分子式为C14H21N3O4。仲丁灵为二硝基苯胺类除草剂，纯品为橙黄色结晶体，易溶于有机溶剂，而难溶于水，有挥发性，受光后易分解，对人畜等动物类毒性较低。该药为选择性萌前除草剂，其作用与氟乐灵相似。药剂进入植物体后，主要抑制分生组织的细胞分裂，从而抑制杂草的幼芽及幼根生长，导致杂草死亡。仲丁灵可应用于大田作物抑制杂草生长，也可用于水产养殖清除水体中的杂藻，仲丁灵在烟草生产中应用较多，主要用来抑制烟草叶芽生长。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）规定烟草中仲丁灵的指导性残留限量为5mg/kg。目前，有关仲丁灵残留检测的研究多集中在气相色谱法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法、液相色谱串联质谱等色谱质谱方法，仪器方法虽具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是样本前处理繁琐、耗时，需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于仲丁灵残留量检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测方法。本专利技术的试检测仲丁灵残留量的酶联免疫试剂盒，包括：包被有仲丁灵偶联抗原的酶标板、仲丁灵单克隆抗体、酶标记抗抗体、仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述仲丁灵单克隆抗体是以仲丁灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述仲丁灵偶联抗原是由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，所述仲丁灵半抗原是由4-氯-3,5-二硝基苯乙酸与丁胺反应得到，其分子结构式为：。所述仲丁灵半抗原的具体制备方法如下：取4-氯-3,5-二硝基苯乙酸1.00g，加50mL乙醇溶解，加碳酸钠0.45g，搅拌，加丁胺0.31g，80℃油浴加热，搅拌3h，检测，原料基本反应完全；停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去乙醇，加80mL水，用1mol/L盐酸调节pH值到4，有大量浑浊，加80mL乙酸乙酯萃取，水洗，上硅胶柱，用体积比为5:1的二氯甲烷/甲醇洗脱分离，得到仲丁灵半抗原产物1.05g。所述酶标记抗抗体中的抗抗体为羊抗鼠抗抗体。所述酶标记抗抗体中的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。所述仲丁灵标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、10μg/L、30μg/L、90μg/L、270μg/L、810μg/L。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.05%吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，其中的百分比为质量体积百分比，单位g/mL。所述复溶液优选为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μL封闭液，37℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。其中，在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.4，含有1%~3%(g/mL)酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。本专利技术的检测原理为：在微孔条上预包被仲丁灵偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入仲丁灵单克隆抗体溶液，样本中的仲丁灵与酶标板上包被的仲丁灵偶联抗原竞争仲丁灵单克隆抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与仲丁灵的残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中仲丁灵的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样本中仲丁灵残留量的浓度范围。本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测仲丁灵残留量的方法，它包括步骤：1）样本前处理；2）用试剂盒进行检测；3）分析检测结果。本专利技术检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样本中仲丁灵的残留量；对样本的前处理要求低，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样本；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行；本专利技术的半抗原具有适当末端活性基团，修饰位点及间隔臂长度选择合适，且能最大程度模拟仲丁灵的分子结构，以此半抗原为基础开发的试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测。附图说明图1：仲丁灵半抗原合成路线图，图2：试剂盒标准曲线图（该图为摘要附图）。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1试剂盒组分的制备1、仲丁灵半抗原的合成（合成路线见附图1）及鉴定取4-氯-3,5-二硝基苯乙酸1.00g，加50mL乙醇溶解，加碳酸钠0.45g，搅拌，加丁胺0.31g，80℃油浴加热，搅拌3h，检测，原料基本反应完全；停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去乙醇，加80mL水，用1mol/L盐酸调节pH值到4，有大量浑浊，加80mL乙酸乙酯萃取，水洗，上硅胶柱，用体积比为5:1的二氯甲烷/甲醇洗脱分离，得到仲丁灵半抗原产物1.05g，收率92.11%。核磁鉴定1HNMR（CDCl3,300MHz）δ：11.01（1H,d,J=0.000），8.281（1H,d,J=0.000），4.011（1H,tq,J=6.914,J=6.757），8.281（1H,d,J=0.000），3.822（t,2H），2.791（1H,ddd,J=7.114,J=6.914），1.591（2H,d,J=6.757），1.251（3H,t,J=7.114），0.901（3H,t,J=7.114）。图谱中，化学位移δ=1.591、1.251、0.901、2.791的为原料丁胺上甲基和亚甲基氢共振吸收峰，δ=4.011的为原料丁胺反应后形成亚胺氢的共振吸收峰，这些峰的存在证明间隔臂偶联成功，仲丁灵半抗原结构正确。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有仲丁灵偶联抗原的酶标板、仲丁灵单克隆抗体、酶标记抗抗体、仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述仲丁灵单克隆抗体是以仲丁灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述仲丁灵偶联抗原是由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，所述仲丁灵半抗原是由4‑氯‑3,5‑二硝基苯乙酸与丁胺反应得到，其分子结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测仲丁灵的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有仲丁灵偶联抗原的酶标板、仲丁灵单克隆抗体、酶标记抗抗体、仲丁灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述仲丁灵单克隆抗体是以仲丁灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述仲丁灵偶联抗原是由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，所述仲丁灵半抗原是由4-氯-3,5-二硝基苯乙酸与丁胺反应得到，其分子结构式为：。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述仲丁灵半抗原的制备反应过程如下：。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体中的抗抗体为羊抗鼠抗抗体。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体中的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由底物液A液和...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎，范子彦，鲁亚辉，刘玉梅，刘惠民，唐纲岭，颜权平，潘立宁，申梁，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，国家烟草质量监督检验中心，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41