用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用。发明专利技术人前期筛选得到120个在短颌鲚和刀鲚之间具有显著性差异的SNP位点，21个湖鲚和刀鲚之间的差异位点。本发明专利技术针对120个位点中分化指数为1的位点，从中挑选20个用于引物设计；针对21个位点中分化指数较高的位点，挑选出10个设计引物。研究结果表明：短颌鲚与刀鲚可以使用以上19个SNP分子标记中的任何一个完全分开。而用于区分湖鲚与刀鲚的10个SNP分子标记中有8个在所测样本中可以扩增并用于物种鉴定。本发明专利技术提供了稳定、高效和低成本识别短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚的方法，为今后刀鲚的物种鉴定和资源保护提供了有效的工具。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，是用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用。
技术介绍
在我国，刀鲚主要分为2个生态型，分别为江海洄游型和湖泊定居型。但对于定居型短颌鲚、湖鲚与洄游型刀鲚的分类一直备受争议。刀鲚是一种具有很高经济价值的鱼类，在巨大的利润推动下，许多商人利用短颌鲚和湖鲚冒充长江刀鲚。短颌鲚、湖鲚和刀鲚之间如何区分，一直是很多学者研究的热点。早期分类学研究为判别刀鲚不同生态型提供了形态学的依据，依据形态学特征鉴定物种方便易行又简单直观,也是鲚属鱼类在分类问题的研究中最常使用的分类方法。但是通过形态学方法进行物种鉴定一直存在局限性。第一，表型可塑性会影响形态特征，并导致用物种鉴定的错误。第二，由于一些关键性的形态学特征只适用于特殊的生命阶段，很多个体无法被准确的识别。随着分子生物学的发展，运用同工酶位点、微卫星标记、细胞色素b，以及线粒体控制区序列来探究刀鲚种群结构的研究越来越多，但不同学者利用不同方法得到的实验数据及分析结果也存在较大差异。所以以上几种方法都不能够准确的提供分子标记用于区分短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚。另一方面，近10年来，由于水体环境污染、洄游通道受阻以及捕捞过度等原因，刀鲚的资源产量急剧下滑，因此我们急需一种快速高效的方法来区分短颌鲚和刀鲚，湖鲚和刀鲚，从而更有针对性的保护资源。在没有准确的分子标记可用的情况下，使用耳石微量元素检测的方法确实可以判断每尾鱼的生活史，验证它为洄游型或定居型个体。但是基于耳石的方法成本高、过于耗时；而且，由于耳石的方法对鱼体的大小有一定的要求，不能够用于确定仔鱼和受精卵是否为洄游型刀鲚的后代。因此，现在急需一种快速高效的方法来区分短颌鲚和刀鲚，湖鲚和刀鲚，从而更好的保护鲚属渔业资源。而分子标记的稳定性好，现被广泛地应用于鱼类种群识别、种群遗传结构、遗传作图等理论研究，以及鱼类保护生物学和鱼类遗传育种等实践领域。中国专利文献CN106282334A公开了一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记及其应用，通过检测位于刀鲚和短颌鲚的线粒体COI基因上的标记来鉴别刀鲚和短颌鲚。中国专利文献CN106434642A公开了用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法。然而现有技术中，关于本专利技术用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记。本专利技术的第二个目的是，提供用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合。本专利技术的第三个目的是，提供一种用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP芯片。本专利技术的第四个目的是，提供如上所述SNP分子标记和SNP分子标记组合的用途。本专利技术的第五个目的是，提供一种鉴定短颌鲚和刀鲚的方法。本专利技术的第六个目的是，提供一种鉴定湖鲚和刀鲚的方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1-54任一所示。其中SEQIDNO.1-38用于区分短颌鲚和刀鲚，SEQIDNO.39-54用于区分湖鲚和刀鲚。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合，包括SEQIDNO.1-5所示的分子标记中的任意两个或多个。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP芯片，所述SNP芯片包含SEQIDNO.1-54所示的分子标记中的任意一个、两个或多个。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的分子标记在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。如上所述的分子标记组合在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。本专利技术进一步还提供检测如上所述SNP分子标记的试剂在制备鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的试剂盒或检测装置中的应用。优选的，所述试剂包含下表中的核苷酸序列；优选的，所述试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。需要说明的是，在获知本专利技术公开的多个单核苷酸多态性位点后，本领域技术人员可用本领域已知的多种技术在DNA水平、RNA水平检测本专利技术所述的多个单核苷酸多态性位点。例如：可以采用直接测序的方法，通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对DNA直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(Pyrosequencing)、微测序(SNaPshot)等。焦磷酸测序技术适于对已知的短序列的测序分析，其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。SnaPshot技术平台是AppliedBiosystems，ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒，可对多个SNP位点同时进行基因分型，也被称为minisequencing，该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Genemapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。也可以采用基于杂交的方法，具体包括Taqman探针法，DNA芯片法等。TaqManSNP基因分型原理：利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或PCR产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型；在PCR反应终点读取分型数据。DNA芯片技术：待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理：紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)。该分析技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1‑54任一所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1-54任一所示。2.用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合，其特征在于，包括SEQIDNO.1-54所示的分子标记中的任意两个或多个。3.一种用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片包含SEQIDNO.1-54所示的分子标记中的任意一个、两个或多个。4.权利要求1所述的分子标记在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。5.权利要求2所述的分子标记组合在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。6.检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂在制备鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的试剂盒或检测装置中的应用。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨虹，陶紫玉，程方圆，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31