一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于药物筛选技术领域，公开了一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用。将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料，然后与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。本发明专利技术的单胺氧化酶A微反应器可应用于天然产物中抗抑郁活性成分的筛选。具有操作简便、自动化程度高的优点，而且能够实现高通量筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用
本专利技术属于药物筛选
，具体涉及一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用。
技术介绍
单胺氧化酶A(MonoamineoxidaseA,MAOA)是一种与线粒体外膜结合的黄素酶，广泛存在于各种组织中[H.G.Brunner,etal.AmericanJournalofHumanGenetics,1993,52,578.]。在人类中，MAOA在脑中单胺类物质的氧化脱氨中起着重要作用，包括5-羟色胺，多巴胺，去甲肾上腺素等神经递质[S.M.Shelke,etal.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2011,21(8):2419-2424.]，并且在人类抑郁情绪和有抑郁行为的啮齿动物模型中检测到前额叶皮质和前扣带皮层中MAOA水平升高[J.H.Meyer,etal.ArchivesofGeneralpsychiatry,2009,66(12):1304-1312；J.H.Meyer,etal.ArchivesofGeneralpsychiatry,2010,67(15):468-474.]。MAOA抑制剂可有效用于抑郁等精神障碍的治疗[H.Checkoway,etal.Neurology,1998,50(5):1458-1461.]。尽管一些已经引入到临床的抗抑郁药物是有效的，但其副作用和高毒性，包括肝毒性和嗜睡等，大大限制了其治疗效果[J.Sarko,etal.EmergencyMedicineClinicsofNorthAmerica,2000,18(4):637-654；M.I.Lucena,etal.ExpertOpiniononDrugSafety,2003,2(3):249-262.]。因此，有必要开发具有良好治疗效果和较低副作用的新型MAOA抑制剂作为临床治疗抑郁症的潜在药物。天然产物是宝贵的资源，含有丰富的生物活性化合物和悠久的历史临床实践。近30年来全世界推出的1562个小分子新化合物中，有75％来源于天然产物，因此，从天然产物中筛选酶抑制剂可能是发现新药的有效方法[J.F.Zhu,etal.Talanta,2016,165:508-515.]。然而天然活性成分发现的常规方法始于从植物药物提取物中分离和鉴定纯化合物，然后对分离的化合物进行后续生物测定[Y.Zhang,etal.AnalyticaChimicaActa,2013,777(5):49-56.]。不幸的是分离程序通常是操作复杂，耗时且成本高。而且目前的MAOA抑制剂筛选方法，例如荧光法[H.M.Guang,etal.ActaPharmacologicaSinica,2010,27(6):760-766.]和分光光度法[K.Zhi,etal.IranianJournalofPharmaceuticalResearchIjpr,2016,15(1):131-139.]，必须先从天然产物中拿到一定数量的化合物分子，才能够进一步测试其单胺氧化酶A抑制活性。此外，分光光度法需要大量酶并且效率低，荧光测定法也存在高成本和操作繁琐等缺点；而且这些筛选方法通常以游离酶为测试对象，由于无法回收再利用，对目标酶造成了极大的浪费。尤其是上述方法只能针对单一化合物进行筛选，对于天然产物等复杂体系中活性化合物的筛选束手无策。因此急需开发操作简单、筛选效率高、灵敏性好的新型MAOA抑制剂筛选方法，用于直接从天然产物中筛选和鉴定酶抑制剂。配体垂钓法是在亲和色谱理论的指导下，运用固定化酶技术，建立起来的复杂体系筛选策略[R.J.Zhuo,etal.Molecules,2016,21(11):1516.]。简言之就是基于活性配体与药物靶点之间的相互作用，将活性配体从复杂的样品体系中筛选出来，一般由靶标固定化、配体垂钓、配体洗脱、HPLC-MS分析四个部分组成。配体垂钓实施的核心是固定化酶技术，是实现复杂体系中目标活性配体的快速筛选的关键。因此结合有效的技术手段，采用恰当的筛选策略，开发新型的抗抑郁筛选方法非常重要。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法。本专利技术方法通过将表面含有氨基的磁性纳米材料使用戊二醛活化后，其表面的醛基与单胺氧化酶A的氨基端经共价交联反应，实现单胺氧化酶A的固定化，制备单胺氧化酶A微反应器。本专利技术的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的单胺氧化酶A微反应器。本专利技术的再一目的在于提供上述单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，包括如下制备步骤：(1)将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料；(2)将步骤(1)所得活化磁性纳米材料与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。优选地，所述含氨基的磁性纳米材料通过如下方法制备得到：将氨基磁珠分散液(可商业购买的原料)经磁分离器固液分离，弃去上清液，得到含氨基的磁性纳米材料。优选地，步骤(1)中所述含氨基的磁性纳米材料在进行活化反应前先使用吡啶溶液清洗。优选地，步骤(1)中所述戊二醛溶液是指用10mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的浓度为5％(v/v)。优选地，步骤(1)中所述活化反应的温度为4℃，反应时间为0.5～3h。优选地，步骤(2)中所述固定化反应中单胺氧化酶A与活化磁性纳米材料的质量比为1:(10～100)。优选地，步骤(2)中所述固定化反应的温度为4℃，反应时间3～16h。优选地，步骤(2)中所得单胺氧化酶A微反应器进一步使用Tris-HCl缓冲液清洗，对固定化反应后的剩余活性醛基进行封端处理。一种单胺氧化酶A微反应器，通过上述方法制备得到。上述单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用。优选地，所述应用步骤如下：将单胺氧化酶A微反应器与待筛选的溶液体系混合反应，固液分离，先用磷酸缓冲溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的非特异性结合组分，然后用100％的甲醇溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的特异性吸附组分，得到抗抑郁药物成分。优选地，所述待筛选的溶液体系是指以含二甲基亚砜(DMSO)的磷酸缓冲液溶解的天然产物溶液体系。优选地，所述混合反应的温度为37℃，反应时间为0.2～1h。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点及有益效果：(1)新型筛选工具。传统以单胺氧化酶A为靶标的抗抑郁药物筛选常采用单一化合物与游离酶一一受试的方式。而本专利技术基于磁性纳米材料构建的单胺氧化酶A微反应器，不仅能够克服游离酶使用次数少造成的浪费，同时也把筛选范围从单一化合物扩大到了天然产物等复杂体系中。(2)新型的筛选方法。传统的天然产物的筛选，多以活性追踪分离为主，需不断提取分离获得目标化合物。而本专利技术在亲和筛选策略的指导下，基于单胺氧化酶A微反应器，构建了复杂体系抗抑郁成分筛选方法，实现了天然产物中抗抑郁活性成分的筛选。该方法不仅操作简单、自动化程度高，而且能够实现高通量筛选。(3)扩展能力强、推广价值大。本专利技术的创新性尝试不仅为筛选以单胺氧化酶A为靶标的新型抗抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：(1)将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料；(2)将步骤(1)所得活化磁性纳米材料与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。

【技术特征摘要】
1.一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：(1)将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料；(2)将步骤(1)所得活化磁性纳米材料与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。2.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于所述含氨基的磁性纳米材料通过如下方法制备得到：将氨基磁珠分散液经磁分离器固液分离，弃去上清液，得到含氨基的磁性纳米材料。3.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述戊二醛溶液是指用10mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的体积浓度为5％；所述活化反应的温度为4℃，反应时间为0.5～3h。4.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述固定化反应中单胺氧化酶A与活化磁性纳米材料的质量比为1:(10～100)；所述固定化反应的温度为4℃，反应时间3～16h。5.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正瑾，张岩岩，张婷婷，王启钦，陈维佳，刘蕊洁，刘佳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44