G-蛋白偶联受体激酶2的用途制造技术

G‑蛋白偶联受体激酶2的用途，属于肺动脉高压和心力衰竭治疗领域，具体为G‑蛋白偶联受体激酶2在制备检测治疗肺动脉高压和心力衰竭产品中的应用。本发明专利技术提供了小檗碱以GRK2为靶点，抑制其表达及活性，可用于治疗肺动脉高压和心力衰竭，同时可以有效评价小檗碱的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
G-蛋白偶联受体激酶2的用途
本专利技术属于肺动脉高压和心力衰竭治疗领域，具体涉及G-蛋白偶联受体激酶2的用途。
技术介绍
肺动脉高压（pulmonaryarterialhypertension，PAH）是一种肺血管慢性阻塞性疾病，主要以肺血管的内膜增生与纤维化，外膜增厚伴炎症中度浸润，原位血栓和丛状病变为特征。肺中、小血管的不断增生、重构导致管腔逐渐闭塞，肺血管阻力进行性增加，引起右室肥大，最终导致右心衰竭，甚至死亡。PAH的长期预后并不乐观，右心导管确诊PAH后，其1、3、5和7年的生存率分别为85%、68%、57%及49%，寻求有效干预措施对于提高PAH患者生存率、改善生存质量具有极其重要的意义。目前，PAH的治疗主要通过药物舒张肺血管和缓解症状为主，如内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物、磷酸二酯酶-5抑制剂和Rho激酶等，但这些药物因价格昂贵、长期有效性有限且存在复杂的副作用等问题，限制了临床使用。因此，深入探讨肺动脉高压的发病机制，寻找更加廉价、有效、安全的药物及靶点意义重大。小檗碱（berberine，BBR）是从黄连、黄柏、三颗针中提取的异喹林生物碱，具有广谱的抑菌作用，临床上主要作为非处方药治疗胃肠道炎症和细菌性痢疾。目前已证实小檗碱具有改善胰岛素抵抗、治疗代谢综合征、减轻炎症及降低胆固醇等作用，对代谢性疾病、感染性疾病、抑郁及肿瘤等均有良好疗效。近年众多研究也揭示了其在心血管系统疾病中的治疗作用。文献报道：小檗碱通过增强自噬在压力过载性心肌肥厚中起到保护作用；调节氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路抑制心肌肥大；调节Akt和ERK活性抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移，改善血管重构等等。此外，研究提示小檗属植物提取物可改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，但是具体作用和机制尚不清楚，还待进一步研究。G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布在心、脑、肺、肾、骨骼肌等组织且具有重要调节功能。慢性心力衰竭中，抑制心肌GRK2的表达及活性，可增强心肌收缩力，逆转心室重塑，改善心功能。此外，抑制GRK2的活性可显著提高血管内皮细胞一氧化氮生物利用度，对抗血管紧张素II诱导的高血压。我们通过分离健康供体肺与PAH患者肺动脉，发现GRK2水平在后者肺动脉内显著上升。细胞实验显示，利用小檗碱下调GRK2表达水平及活性后可显著抑制缺氧所致的肺动脉平滑肌的增殖与迁移。上述研究提示抑制GRK2可能是治疗肺动脉高压的新策略。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种G-蛋白偶联受体激酶2的用途，用于检测肺动脉高压和心力衰竭或治疗效果验证评价。技术方案：G-蛋白偶联受体激酶2在制备检测治疗肺动脉高压和心力衰竭产品中的应用。G-蛋白偶联受体激酶2在制备筛选治疗肺动脉高压和心力衰竭药物中的应用。G-蛋白偶联受体激酶2在制备验证或评价肺动脉高压和心力衰竭治疗效果试剂盒中的应用。G-蛋白偶联受体激酶2与小檗碱的复合物在制备验证或评价肺动脉高压和心力衰竭治疗效果试剂盒中的应用。一种验证或评价肺动脉高压和心力衰竭治疗效果试剂盒，包括G-蛋白偶联受体激酶2和小檗碱，或两者的复合物。本专利技术通过实验确定了GRK2表达与PAH之间的关系：1、PAH时肺动脉内GRK2表达明显上调本专利技术分别选用正常供体和肺动脉高压患者肺动脉，正常大鼠和肺动脉高压大鼠肺组织，以及通过低氧刺激后的肺动脉平滑肌细胞，检测了GRK2表达情况。结果表明，肺动脉高压患者和发生肺动脉高压的大鼠肺动脉内GRK2表达明显上调，同样在低氧刺激的肺动脉平滑肌中GRK2表达也呈时间依耐性的显增高（图1、图2、图3）。2、GRK2干扰或过表达对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的影响。本专利技术选用健康人肺动脉平滑肌细胞，发现GRK2沉默显著抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移，GRK2过表达则导致肺动脉平滑肌出现明显的增殖与迁移(图4、图5)。3、GRK2过表达加剧小鼠肺动脉高压。本专利技术选用慢病毒介导的GRK2过表达小鼠与野生型小鼠，并利用SU5416+低氧诱导构建肺动脉高压模型，四周后测定右心室收缩压研究GRK2过表达对肺动脉高压的影响。结果表明GRK2过表达明显增高PAH小鼠右心室收缩压（图6）。本专利技术提供GRK2在小檗碱作为治疗肺动脉高压药物中疗效评价中的应用：1、小檗碱延缓大鼠肺动脉高压发展本专利技术选用SD大鼠，并利用SU5416+低氧诱导构建PAH模型，同时给或不给小檗碱灌胃，观察肺血管重构情况及血流动力学的指标变化。结果表明，小檗碱可明显改善PAH中肺血管重构，降低右心室收缩压，治疗或延缓PAH的发展（图7）。2、小檗碱抑制GRK2表达水平及活性，调节下游AKT信号通路在上述大鼠模型及分离PAH患者肺动脉平滑肌细胞上，分别观察小檗碱对肺组织和细胞水平上GRK2的表达、下游AKT的磷酸化水平的影响；体外实验分析比较小檗碱和GRK2抑制剂帕罗西汀对GRK2活性的抑制作用；分子对接研究小檗碱与人GRK2蛋白作用模式。结果显示，小檗碱与GRK2可形成稳定复合物，抑制GRK2的表达及活性，降低AKT磷酸化水平（图8、图9、图10，图11）。由以上结果可知在肺动脉高压的模型中，GRK2的表达和正常组相比显著增高；下调GRK2的表达后，抑制肺动脉平滑肌的增殖和迁移，缓解肺动脉高压；上调GRK2的表达，促进肺动脉平滑肌的增殖和迁移，肺动脉压力增高，加剧肺动脉高压。因此，GRK2在肺动脉高压疾病中起着重要作用，特别是通过小檗碱抑制GRK2的表达或活性有助于治疗PAH、延缓PAH的发展。有益效果：本专利技术发现了小檗碱以GRK2为靶点，抑制其表达及活性，可以治疗肺动脉高压和心力衰竭，同时可以有效评价小檗碱的治疗效果。附图说明图1是正常供体肺和PAH患者肺动脉内GRK2的蛋白检测图，其中A为蛋白表达水平图，B为蛋白表达量统计柱状图，C为免疫荧光图（C），PAH患者肺动脉内的GRK2表达上调（**：p＜0.01vs正常组）。图2是野生型大鼠与PAH大鼠肺组织内GRK2的蛋白检测图，其中A为蛋白表达水平图，B为蛋白表达量柱状统计图，PAH大鼠肺组织内GRK2明显上调（**：p＜0.01vs对照组）。图3是低氧刺激人肺动脉平滑肌细胞不同时间（12，24，36，48h）后GRK2的蛋白检测图，其中A为蛋白表达水平图，B为蛋白表达量统计柱状图，低氧刺激后GRK2表达水平上调（**：p＜0.01，***：p＜0.001vs对照组）。图4是利用小干扰RNA沉默GRK2后，经低氧刺激，人肺动脉平滑肌细胞检测图，其中A为细胞增殖图，B为细胞迁移能力图，GRK2沉默显著抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移能力（***：p＜0.001vsScrambled-siRNA组，###：p＜0.001vs低氧+Scrambled-siRNA组）。图5是利用过表达腺病毒上调GRK2后，经低氧刺激，人肺动脉平滑肌细胞检测图，其中A为细胞增殖图，B为细胞迁移能力图，GRK2过表达显著增强低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移能力（***：p＜0.001vsAd-Null组；##：p＜0.01vs低氧+Ad-Null组）。图6是野生型小鼠与GRK2过表达小鼠在PAH造模后，右心室收缩压（RVS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.G‑蛋白偶联受体激酶2在制备检测治疗肺动脉高压和心力衰竭产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.G-蛋白偶联受体激酶2在制备检测治疗肺动脉高压和心力衰竭产品中的应用。2.G-蛋白偶联受体激酶2在制备筛选治疗肺动脉高压和心力衰竭药物中的应用。3.G-蛋白偶联受体激酶2在制备验证或评价肺动脉高压和心力衰竭治疗效果试剂盒中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍良，顾月，
申请(专利权)人：陈绍良，
类型：发明
国别省市：江苏,32