本发明专利技术提供了一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法。本发明专利技术公开了一种可高效特异敲除PINK1基因的sgRNA；还提供了通过靶向敲除动物中脑黑质的PINK1基因建立帕金森疾病动物模型的方法，具体通过将sgRNA和CRISPR核酸酶注射至动物大脑黒质部位，对PINK1基因造成目标片段缺失；3～4周后可出现明显帕金森疾病典型运动障碍症状，无药物治疗下运动障碍不可恢复。所述方法直接造成黑质部位神经元死亡，无副作用，成模率逾90％，表型稳定，适用性和重复性好，为帕金森病药物筛选、干细胞治疗、基因缺陷修复治疗及PINK1基因缺失的致病机理研究等提供重要模型，具有巨大的经济价值和临床前研究意义。
【技术实现步骤摘要】
一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种脑黑质基因敲除快速建立帕金森病动物模型的方法。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sDisease,PD)作为仅次于老年痴呆(AD)的第二大神经退行性疾病，在中国65岁以上人群中的发病率高达1～2％(Pringsheimetal.,2014；Koprichetal.2017)。帕金森病的临床症状表现为运动障碍，静止性震颤，肌肉僵直等。该病的病理改变主要是由于中脑黑质中的多巴胺能神经细胞发生变性坏死及伴有胞质内包涵体——路易小体(Lewybody)的出现(Dawsonetal.,2010)。由于大量多巴胺神经元死亡，病人脑中的多巴胺严重减少而导致帕金森病的运动障碍发生。随着人类老龄化增加，帕金森疾病患者也逐渐增多，这对患者本人、家庭和整个社会均造成巨大的负担。目前对于帕金森病没有方法可以延缓或逆转病理进程，其主要原因之一是缺乏合适的动物模型可用于医药开发。为解决这一问题，合格的PD动物模型尤为重要。帕金森疾病的动物模型建立目前主要包括神经毒素模型和遗传基因模型。神经毒素模型常用的有四种：6-羟多巴胺(6-OHDA)模型，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6－四氢吡啶(MPTP)模型，百草枯模型及鱼藤酮模型。其中MPTP诱导的PD模型因建模快而在医学研究中的应用非常广泛，但药物诱导损伤模型的缺点是毒性较大，并不能真正模拟病人的遗传学突变及缓慢发病的进程(PotashkinJAetal,2010)。而遗传基因模型有针对功能获得型突变的转基因动物模型和针对功能缺失型突变的基因敲除模型，这类方法建立的模型基于在猴胚胎时期进行基因修饰(Yangetal.,2015)。虽然此法能够模拟病人的基因突变但受困于技术瓶颈，利用胚胎或干细胞构建相关基因修饰的灵长类动物模型非常困难，且在时间上较为漫长，将耗费巨大人力、物力和财力，不利于大规模的药物筛选。近年来发展的基因编辑新技术CRISPR/Cas9在定向对基因进行精确修饰上展现出了巨大的潜力，已被广泛用于不同种属进行基因组改造和基因修饰。CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas9蛋白对基因进行编辑和修饰的新技术。目前，RNA介导的Cas9系统能够成功介导细菌、植物细胞、斑马鱼胚胎、小鼠、人源细胞、非人灵长类动物食蟹猴胚胎、甚至人类废弃胚胎等的基因组编辑(Choetal.,2013；Congetal.,2013；Jineketal.,2013；Malietal.,2013；Niuetal.,2014；Shanetal.,2013；Chenetal.,2015)。且该技术还可通过基因敲入成功纠正疾病动物的缺陷基因(Schwanketal.,2013；Wuetal.,2013)或者改组为病毒载体建立癌症动物模型(Plattetal.,2014)等。该技术使用方便、简单且打靶效率较高，还可在目的基因的多个位点设计多种gRNA以完全敲除目的基因。PINK1基因突变可因基因功能缺失而导致早发型帕金森疾病。然而，目前报导的所有敲除PINK1基因后的啮齿类动物模型动物都不能有效地模拟帕金森疾病的病理和行为特性。例如，PINK1基因敲除小鼠并不会出现临床PD病人的典型病理特性——中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡和显著的运作障碍(Kitadaetal.,2009)。因此，采用敲除PINK1基因的策略是否能成功制备PD动物模型存在众多不确定因素和不可预见性，而不同种属动物之间的巨大差异进一步加大了研究难度。同时，目前也未见相关通过敲除该基因而成功获得PD大动物模型的报道，因此，对于其中的技术瓶颈与技术困难，有待研究攻破；如何构建与人类更为相似的PD模型也成为PD疾病研究的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种特异靶向PINK1基因的sgRNA，所述的sgRNA可通过CRISPR-Cas9系统造成PINK1基因的DNA大片段缺失，高效实现对PINK1基因的特异性敲除。本专利技术的另一目的在于提供载有所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本专利技术的又一目的在于提供一种帕金森疾病动物模型的建立方法，是基于在帕金森病的易损脑区(中脑黑质)中直接靶向敲除PINK1基因建立的。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一组特异靶向PINK1基因的sgRNA，所述的sgRNA选自下列中的至少一种：(1)PINK1exon2sgRNA:5’-GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG-3’(SEQIDNO.2)，位于PINK1基因的2号外显子；(2)PINK1exon4sgRNA:5’-CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC-3’(SEQIDNO.3)，位于PINK1基因的4号外显子。同时利用所述的两条sgRNA序列，可特异性靶向PINKI基因并高效实现该基因的大片段敲除。含有所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA核苷酸序列的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。所述的表达载体优选为来自于多次筛选确定的CRISPR/Cas9系统质粒载体；进而优选为能有效转染神经细胞的腺相关病毒(AAV)载体。所述的腺相关病毒(AAV)载体优选为通过如下方法得到的表达载体：将px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并将GFP序列替换为RFP序列，从而更好地在脑部的神经细胞及其它细胞中表达RFP并高效敲除PINK1基因。具体操作步骤优选为：通过ApaI和BamHI酶切位点将原px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并通过BamHI和EcoRI酶切位点将GFP序列替换为RFP序列。所述的px552病毒表达载体购自Addgene。所述的细胞优选为非人灵长类动物大脑的细胞。所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或重组表达载体在帕金森疾病动物模型构建中的应用。一种帕金森疾病动物模型的建立方法，通过靶向敲除动物中脑黑质中的PINK1基因实现。所述的动物优选为非人灵长类动物；更优选为猕猴、食蟹猴。具体包括如下步骤：(1)将所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体进行病毒包装；(2)将所述的病毒包装后的sgRNA或其重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体注射至受试动物大脑黒质部位，通过靶向性核酸内切酶对PINK1基因造成目标片段的缺失；3～4周后可出现明显帕金森疾病典型运动障碍症状，无药物治疗下运动障碍不可恢复。该方法可高效实现在中脑黑质中直接靶向敲除PINK1基因。步骤(1)中所述的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体优选按摩尔比1:(1～5)进行配比。步骤(1)优选同时使用所述的两种特异靶向PINK1基因的sgRNA或含有所述sgRNA的重组表达载体；PINK1exon2sgRNA与PINK1exon4sgRNA优选按摩尔比1:1进行配比。步骤(1)中所述的CRISPR核酸酶优选为Cas9。步骤(1)所述的CRISPR核酸酶重组表达载体优选为载有CRISPR核酸酶的A本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组特异靶向PINK1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA选自下列中的至少一种：(1)PINK1 exon 2sgRNA:5’‑GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG‑3’；(2)PINK1 exon 4sgRNA:5’‑CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC‑3’。
【技术特征摘要】
1.一组特异靶向PINK1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA选自下列中的至少一种：(1)PINK1exon2sgRNA:5’-GGCTGGAGGAGTATCTGATAGGG-3’；(2)PINK1exon4sgRNA:5’-CCGGGTTCTCCGCGCTTTCACC-3’。2.含有权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA核苷酸序列的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为CRISPR/Cas9系统质粒载体。4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为通过如下方法得到的表达载体：将px552病毒表达载体中的hSyn序列改造为CMV启动子序列，并将GFP序列替换为RFP序列得到的表达载体。5.权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体在帕金森疾病动物模型构建中的应用。6.一种帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于：通过靶向敲除动物中脑黑质中的PINK1基因实现。7.根据权利要求6所述的帕金森疾病动物模型的建立方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的特异靶向PINK1基因的sgRNA或权利要求2～4任一项所述的重组表达载体和CRISPR核酸酶或其重组表达载体进行病毒包装；(2)将所述的病毒包装后的...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭祥玉，杨伟莉，李世华，李晓江，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。