本发明专利技术涉及分子生物学和基因表达调控技术领域，具体涉及一种miRNA‑340靶基因结合序列、重组质粒及其应用，该序列包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：19所示的核苷酸序列。本发明专利技术的miRNA‑340靶基因结合序列能够与miRNA‑340结合，其构建的重组质粒能够快速、灵敏、简便地鉴定目标microRNA是否结合IL‑17A 3’UTR调控片段从而起调控作用。
【技术实现步骤摘要】
miRNA-340靶基因结合序列、重组质粒及其应用
本专利技术涉及分子生物学和基因表达调控
，具体涉及一种miRNA-340靶基因结合序列、重组质粒及其应用。
技术介绍
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类仅有18～25个核苷酸的单链小分子RNA，广泛存在于线虫、果蝇、植物和包括人在内的真核生物中,具有高度的保守性、组织特异性和时序性的非编码RNA分子，不具有开放阅读框(openreadingframe)。microRNA的基因位于遗传编码基因的内含子中,也有一部分存在与基因间DNA序列中,形成成熟的microRNA后发挥调控转录后作用。可通过与靶基因的3’端非编码区域(3’UTR)互补配对，在转录后水平对靶基因进行负调控，导致mRNA翻译抑制或者降解，在胚胎发育、细胞分化、凋亡、肿瘤形成等方面发挥着多元化调控作用。已有研究报道，miRNA-340在肿瘤的发病机制中起到非常重要的作用，并在不同类型的肿瘤研究中，发挥致癌或抑癌的调节作用，通过抑制相关致癌基因包括p-AKT、EZH2、表皮生长因子受体等，或通过靶向相关基因抑制肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌，乳腺癌等发挥抑癌症作用。同时，miRNA-340也可能调节免疫细胞的分化与功能。有研究发现，miRNA-340可通过下调IL-4、Bmi-1等基因靶点来抑制Th2细胞分化，使实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中的Th2细胞向Th1细胞亚群偏移。进一步了解，miRNA-340抑制Th2通路可促进Th1、Th17细胞的分化，但是否直接靶向IL-17A影响Th17细胞，尚未有研究报道。临床上多发性硬化根据病程特点分为复发-缓解型、继发进展型和原发进展型，有研究发现，从前2种分型患者外周血中分离的记忆性T细胞高度表达miRNA-340，但在原发进展型患者中表达未见明显变化，甚至在活动性硬化斑中有降低现象；同时过表达髓磷脂特异性T细胞中miRNA-340、miRNA-27、miRNA-128可加重小鼠EAE表型。根据miRBase数据库，目前所发现的miRNAs已超过700个，随着高通量测序的应用，将会有更多的新的miRNAs被发现。可能近90％的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，主要根据已证实的miRNA及其靶基因序列之间相互作用的规律性，遵循几个常用原则设计的软件完成,如miRanda,TargetScan和TargetScanS,RNAhybrid,DIANA-microT,PicTar,及FindTar等。此外，利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因。目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRNA水平来寻找靶基因主要是通来在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。目前鉴定靶基因最直接的方法是，利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点。而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法，其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体,将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR构建到荧光素酶基因的3’UTR中,然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平,最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。17型辅助性T细胞(Th17)是CD4+T细胞的分化亚型，在自身免疫相关性疾病的发病机制中占据重要的作用。白介素-17A(IL-17A)是Th17分泌的主要细胞因子，在炎症反应中对白细胞的迁移和活化等方面发挥重要作用。银屑病是是影响最为广泛的3大自身免疫病之一，病征表现为皮肤增厚和广泛性损害，可引起瘙痒、鳞屑和疼痛，并严重影响患者的生活质量、心理健康以及社会关系。此外，病症较重者易患合并症，如关节炎、心脏病和糖尿病，具有死亡风险。目前，LeslievanderFits等人已经证实自身免疫性银屑病主要由IL-23/IL-17A炎症轴介导，其病理过程主要为：致病因素(如遗传、环境、感染以及物理损伤等)导致先天性免疫细胞(如角质细胞、自然杀伤细胞等)分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性因子，激活树突状细胞等先天免疫细胞。活化的树突状细胞迁移到皮肤淋巴结等免疫器官中，提呈抗原并分泌IL-23等促炎性因子，促使naiveCD4+T细胞向Th17分化。分化的自身反应性Th17从皮肤的毛细血管中迁移出，浸润到皮肤中的炎症部位。在获得自身抗原的再刺激后，持续增殖并分泌IL-17A等多种炎性因子。IL-17A等因子可激活角质细胞，刺激其增殖，形成银屑症状。另一方面，活化的角质细胞又可分泌抗菌肽(如LL-37抗菌肽和β-防御素)、促炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、趋化因子(CXCL8-11、CCL20)以及S100蛋白等，这些因子又可激活先天性免疫细胞，导致炎症恶性循环，从而维持并加重银屑病发展。可见，IL-17A在银屑病先天免疫和适应性免疫的炎症回路中扮演着重要的桥联作用。当然，IL-23/IL-17A炎症轴仅仅是银屑病病理过程中的某一重要的环节。近期研究发现γδT细胞以及巨噬细胞也可分泌IL-17A而促进银屑病的发生发展，Th22细胞可分泌IL-22而加重银屑病的发展，其余病理环节还有待发现。有研究发现，类风湿性关节炎患者关节滑膜液和外周血中IL-17表达升高，IL-17可以通过刺激滑膜细胞表达分泌角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、和肝素结合性表皮生长因子等血管因子促进血管翳的形成,在类风湿性关节炎的早期即发挥破坏作用；通过诱导滑膜细胞和软骨细胞表达金属蛋白酶,使蛋白多糖分子断裂,破坏软骨组织；刺激破骨细胞的生成，在骨质破坏反应中对破骨细胞的活化和骨质的吸收方面发挥着重要作用。此外，在多发性硬化、系统性红斑狼疮等免疫相关性疾病的研究中均发现IL-17表达异常，并将IL-17mRNA或蛋白表达量与疾病轻重程度的相关性作为诊断和治疗的监测指标。目前，自身免疫性疾病的治疗通常采用的糖皮质激素、免疫抑制剂等，,虽然有一定疗效，但长期使用都会产生严重的不良反应,而且都只能减缓病情的发展,并不能根治疾病。近10余年,单克隆抗体治疗自身免疫性疾病已成为研究热点，各大医药公司正积极开发以IL-23、IL-17或IL-17受体等为靶点的单抗药物用来治疗银屑病，其中诺华公司研发的Secukinumab在2015年年初获欧盟批准，系全球首个IL-17单抗。出于安全性考虑，中轻度患者在短期内不能享用这些单抗药物。因此，明确本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种miRNA‑340靶基因结合序列，其特征在于，该序列包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：19所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种miRNA-340靶基因结合序列，其特征在于，该序列包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：19所示的核苷酸序列。2.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒包括如权利要求1所述的miRNA-340靶基因结合序列。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒从5’端至3’端依次包括如下元件：启动子序列、报告基因、如权利要求1所述的miRNA-340靶基因结合序列和终止序列。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒包括荧光素酶报告基因质粒pmir-GLO和所述miRNA-340靶基因结合序列，所述miRNA-340靶基因结合序列位于所述荧光素酶报告基因质粒的NheI酶切位点和XhoI酶切位点之间。5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求2-4任一项所述的重组质粒。6.一种筛选或鉴定IL-17负调控制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：构建如权利要求4所述的重组质粒；使测试试剂与所述重组质粒共转染真核细胞；培养转染后的真核细胞，检测转染后的真核细胞分泌的荧光素酶活性；其中，如果荧光素酶活性降低，则所述测试试剂被鉴定为IL-17负调控制剂。7.根据权利要求6所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮庆国，边江，刘芮伶，王绍文，耿雯雯，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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