本发明专利技术公开了一种提高4‑α‑糖基转移酶可溶性表达水平的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术的方法从4‑α‑糖基转移酶的发酵生产工艺入手，通过在4‑α‑糖基转移酶生产菌株的发酵培养基中添加一定量的氧化三甲胺和/或脯氨酸，以提高其对4‑α‑糖基转移酶的表达水平；采用本发明专利技术的方法发酵48h，可成功将细胞破碎上清液中的4‑α‑糖基转移酶酶活提高至1302.6U/mL；且本发明专利技术的方法具有工艺简单易行，适合工业化生产的优点。
【技术实现步骤摘要】
一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法
本专利技术涉及一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，属于发酵工程
技术介绍
5-α-糖基转移酶是一种多功能酶，属于淀粉水解酶家族。由于4-α-糖基转移酶具有独特的催化特性，可以催化环化、歧化、水解和偶合四种反应，使其在改性淀粉、大环糊精等生产中具有广泛的用途。如在淀粉改性方面，ChoK.H.等人应用来源于栖热水生菌的4-α-糖基转移酶对大米淀粉进行处理，结果表明经过该酶处理后，淀粉的回生现象得到很大程度的抑制，HaV.Do等人应用来源于栖热水生菌的4-α-糖基转移酶制备淀粉凝胶，分别测定不同加酶量、不同处理时间下玉米淀粉凝胶的质构特性，最终制备出粘弹性较好的理想凝胶，也有研究已经证实，采用微生物来源的4-α-糖基转移酶制备淀粉质凝胶，可以得到与明胶性质相似的淀粉质凝胶；在生产大环糊精方面，4-α-糖基转移酶可以通过其环化作用转化淀粉生成大环糊精，实现一步法制备大环糊精。因此，如何实现4-α-糖基转移酶的工业生产以及高效生产一直是一个研究热点。目前，已经有许多研究是基于基因工程技术，通过构建基因工程菌以尝试提高4-α-糖基转移酶的表达量，如许燕等构建产栖热水生菌嗜热4-α-糖基转移酶重组大肠杆菌，并对该没进行了纯化和性质分析，结果显示该酶比活力为156.25U/mg，该酶可以催化淀粉制备大圆环糊精，最高转化率为45.58％；张磊等构建了产ThermusthermophilusHB84-α-糖基转移酶重组大肠杆菌，采用两步法获得了纯酶，该酶可以催化麦芽糖生成葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖。但是，上述研究或者对4-α-糖基转移酶的表达依处在一个很低的水平，或者由于表达量过低而没有报道酶的实际表达量，因此，如何实现4-α-糖基转移酶的工业生产以及高效生产仍需进一步研究。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法。此方法从4-α-糖基转移酶的发酵生产工艺入手，通过在4-α-糖基转移酶生产菌株的发酵培养基中添加一定量的氧化三甲胺和/或脯氨酸，以提高其对4-α-糖基转移酶的表达水平；采用此方法发酵48h，可成功将细胞破碎上清液中的4-α-糖基转移酶酶活提高至1302.6U/mL；且此方法具有工艺简单易行，适合工业化生产的优点。本专利技术技术方案如下：本专利技术提供了一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，所述方法为使用添加了氧化三甲胺和/或脯氨酸的发酵培养基进行发酵培养；所述发酵培养所用的生产菌株为可产4-α-糖基转移酶的菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述生产菌株包含可产4-α-糖基转移酶的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌包含产4-α-糖基转移酶的重组枯草芽孢杆菌以及可产4-α-糖基转移酶的重组大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETduet-GroES-GroEL-4GT或重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168/pHT01-4GT。在本专利技术的一种实施方式中，所述氧化三甲胺在发酵培养基中的添加量为0.5～10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述氧化三甲胺在发酵培养基中的添加量为2.3g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述脯氨酸在发酵培养基中的添加量为0.5～5g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述所述脯氨酸在发酵培养基中的添加量为1.15g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含甘油4～10g/L、蛋白胨0.5～3g/L、酵母粉0.5～5g/L、KH2PO45～15g/L、(NH4)2HPO41～6g/L、柠檬酸0.5～4g/L、MgSO40.2～1.5g/L以及微量元素液5～20mL/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述所述发酵培养基的成分包含甘油8g/L、蛋白胨1g/L、酵母粉2g/L、KH2PO413.5g/L、(NH4)2HPO44g/L、柠檬酸1.7g/L、MgSO40.68g/L以及微量元素液10mL/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素液的成分包含FeSO4·7H2O5～20g/L、ZnSO4·7H2O1.5～5g/L、CuSO4·5H2O0.5～2g/L、MnSO4·4H2O0.2～1.0g/L、Na2B4O7·10H2O0.1～0.5g/L、CaCl20.5～5g/L、(NH4)6Mo7O25～50g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素液的成分包含FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O1.0g/L、MnSO4·4H2O0.5g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CaCl22.0g/L、(NH4)6Mo7O240.1g/L。本专利技术提供了上述一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法在4-α-糖基转移酶制备、淀粉改性以及大环糊精生产方面的应用。有益效果：本专利技术的方法从4-α-糖基转移酶的发酵生产工艺入手，通过在4-α-糖基转移酶生产菌株的发酵培养基中添加一定量的氧化三甲胺和/或脯氨酸，以提高其对4-α-糖基转移酶的表达水平；采用本专利技术的方法发酵48h，可成功将发酵上清液中的4-α-糖基转移酶酶活提高至1302.6U/mL；且本专利技术的方法具有工艺简单易行，适合工业化生产的优点。附图说明图1：重组菌株在添加不同种类化学添加剂培养基中摇瓶发酵细胞破碎上清样品SDS-PAGE电泳图；图2：重组菌株在3-L发酵罐中菌体生长及产酶曲线。具体实施方式通过以下的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细解释及阐述。下述实施例中涉及的培养基如下(以g/100mL计)：摇瓶LB液体培养基：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0；摇瓶TB发酵培养基：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O16.43，KH2PO42.3；3L发酵罐发酵培养基：甘油8，蛋白胨1，酵母粉2，KH2PO413.5，(NH4)2HPO44，柠檬酸1.7，MgSO40.68，微量元素液10mL/L；微量元素液：FeSO4·7H2O10，ZnSO4·7H2O2.25，CuSO4·5H2O1.0，MnSO4·4H2O0.5，Na2B4O7·10H2O0.23，CaCl22.0，(NH4)6Mo7O240.1；3L发酵罐补料培养基：甘油500，MgSO4·7H2O20，蛋白胨15，酵母粉30，氧化三甲胺2.3。下述实施例中涉及的检测方法如下：4-α-糖基转移酶酶活检测方法：(1)酶活力测定方法：配制1％的麦芽糖溶液，即称取0.10g麦芽糖溶解PBS(20mM·L-1，pH7.4)中，然后每个离心管分装300μL，放置75℃水浴锅加热5min。取出冰上加50μL的酶，空白对照管加50μL的去离子水，再放置75℃水浴锅加热30min。加热结束后，取出冰上，生物传感分析仪测定葡萄糖的量(以同样条件下用缓冲液代替酶液的反应体系作为空白对照)。酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，1h水解麦芽糖产生1μM的葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。(2)样品处理及检测将菌液样品稀释适当倍数，用分光光度计在波长600nm处测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高4‑α‑糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述方法为使用添加了氧化三甲胺和/或脯氨酸的发酵培养基进行发酵培养。
【技术特征摘要】
1.一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述方法为使用添加了氧化三甲胺和/或脯氨酸的发酵培养基进行发酵培养。2.如权利要求1所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述氧化三甲胺在发酵培养基中的添加量为0.5～10g/L。3.如权利要求1或2所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述氧化三甲胺在发酵培养基中的添加量为2.3g/L。4.如权利要求1-3任一所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述脯氨酸在发酵培养基中的添加量为0.5～5g/L。5.如权利要求1-4任一所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述所述脯氨酸在发酵培养基中的添加量为1.15g/L。6.如权利要求1-5任一所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含甘油4～10g/L、蛋白胨0.5～3g/L、酵母粉0.5～5g/L、KH2PO45～15g/L、(NH4)2HPO41～6g/L、柠檬酸0.5～4g/L、MgSO40.2～1.5g/L以及微量元素液5～20mL/L。7.如权利要求1-6任一所述的一种提高4-α-糖基转移酶可溶性表达水平的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：段绪果，张心怡，周烽华，曹佳睿，沈镇炎，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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