一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明专利技术采用GRAS微生物枯草芽孢杆菌为宿主，以三种地衣芽孢杆菌基因组为模板使用聚合酶链式反应扩增出三种启动子Pblma、Pnpu和Pαgly，并将三种启动子与古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因及载体联接，转化枯草芽孢杆菌宿主菌，得到三株枯草芽孢杆菌重组菌。在合适的培养基中培养本发明专利技术的重组菌，生产古细菌淀粉普鲁兰酶，可以提高普鲁兰酶的产率和活性。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，具体涉及一种用于表达古细菌淀粉普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于微生物基因工程及发酵工程领域。
技术介绍
淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase)，也称为第2种类型的普鲁兰酶(type2pullulanase)，能够催化淀粉和普鲁兰多糖中α-1,6-葡萄糖苷键和α-1,4-葡萄糖苷键的水解；具有(β/α)7催化结构，在催化反应中，以谷氨酸残基作为亲核基团，隶属于糖苷水解酶GH57家族。古细菌Thermococcus、Pyrococcus、Staphylothermus、Caldivirga和Thermofilum等属的淀粉普鲁兰酶，最适催化反应温度为85-110℃，在淀粉改性、生产麦芽糊精等领域具有较好的应用前景。本专利技术所涉及的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu来自古细菌StaphylothermusmarinusF1。古细菌生长所需要的培养基成分复杂，培养过程中常常需要较高(或较低)的温度、较强的酸性(或碱性)条件，有些还需要严格的厌氧环境，并释放出有毒的气体。为了研究古细菌淀粉普鲁兰酶，目前主要采用易于培养的微生物大肠杆菌Escherichiacoli进行基因重组表达。但是，大肠杆菌是人类的致病菌，生长过程中还会产生内毒素，所以不适于作为食品用酶的宿主菌。枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis不产生内毒素，是一种公认安全(generallyrecognizedassafe，GRAS)的细菌，已成为多种食品用酶的工业生产菌。然而，古细菌具有密码子使用偏好性，表现为古细菌所经常使用的一些氨基酸密码子，而细菌却很少使用；这常常导致古细菌基因在细菌中不能正确表达或者表达量太低。来自糖苷水解酶GH57家族的古细菌淀粉普鲁兰酶基因，也常常由于没有合适的启动子和稳定的载体，而难于在枯草芽孢杆菌中异源表达。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述的重组菌含有Pblma、Pnpu或Pαgly启动子和古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因，所述的Pblma、Pnpu或Pαgly启动子的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示，所述的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因核苷酸序列如序列表SEQIDNO.4所示。所述的重组菌的构建方法具体为：以地衣芽孢杆菌B.licheniformisDSM13(德国微生物及细胞保藏中心DSMZ保藏)、B.licheniformisATCC9789、或B.licheniformisATCC27811(美国典型培养物保藏中心ATCC保藏)基因组为模板，用聚合酶链式反应(PCR)扩增出Pblma、Pnpu或Pαgly启动子，将任意一个启动子及古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因与表达载体pUBRT29进行联接重组，构建重组质粒，然后转化至枯草芽孢杆菌中得到重组菌。所述的表达载体质粒pUBRT29，该质粒的构建方法已于2010年在论文《EnzymaticsynthesisofglycosylatedpuerarinusingmaltogenicamylasefromBacillusstearothermophilusexpressedinBacillussubtilis.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture》中公开。本专利技术还保护以上任意一种所述枯草芽孢杆菌重组菌在制备古细菌普鲁兰酶中的应用。一种应用上述枯草芽孢杆菌重组菌生产古细菌普鲁兰酶的方法，该方法包括在合适的培养基中培养本专利技术的任何枯草芽孢杆菌重组菌，得到普鲁兰酶。本专利技术的枯草芽孢杆菌重组菌古细菌普鲁兰酶产量高，而且使用本专利技术方法生产的古细菌普鲁兰酶具有耐高温性能，在100℃条件下仍具有较高的活性。本专利技术为古细菌普鲁兰酶在食品行业的应用奠定了基础。附图说明图1重组质粒pUBRT-Pblma的构建过程图；图2重组质粒pUBRT-Pblma、pUBRT-Pnpu、pUBRT-Pαgly的PCR验证图；图3从pUBRT-Pblma枯草芽孢杆菌重组菌摇瓶发酵液中纯化古细菌淀粉普鲁兰酶各阶段的SDS-PAGE电泳图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pUBRT29质粒：构建方法参考文献：Choi,C.H.,Kim,S.H.,Jang,J.H.,Park,J.T.,Shim,J.H.,Kim,Y.W.,Park,K.H.(2010).EnzymaticsynthesisofglycosylatedpuerarinusingmaltogenicamylasefromBacillusstearothermophilusexpressedinBacillussubtilis.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,90,1179-1184。枯草芽孢杆菌：大多为从自然环境分离或已知的人工突变株，如枯草芽孢杆菌B.subtilisISW1214(leuA8metB5hsrM1)，B.subtilis168等。本专利技术使用的枯草芽孢杆菌宿主菌为B.subtilisISW1214。地衣芽孢杆菌B.licheniformisDSM13：德国微生物及细胞保藏中心DSMZ保藏。地衣芽孢杆菌B.licheniformisATCC9789和B.licheniformisATCC27811：美国典型培养物保藏中心ATCC保藏。实施例1枯草芽孢杆菌重组菌的构建(1)启动子Pblma、Pnpu和Pαgly的制备分别以地衣芽孢杆菌B.licheniformisDSM13、B.licheniformisATCC9789和B.licheniformisATCC27811的基因组DNA(100ng，2μL)为模板，加入缓冲液(Mg2+plus，10μL)，灭菌蒸馏水(31.5μL)，dNTP(2.5mMeach，4μL)，正向引物：(F-BamHI,5′-ATTGGATCCTGAGGCTGTTTCTCGACCGGA-3′；10μM，1μL)，和反向引物：(R-SalI,5′-CAAGTCGACCATATGGTTTCCCCCTTTTGG-3′；10μM，1μL)，用HSDNAPolymerase聚合酶(2.5U/μL，0.5μL)催化聚合酶链式反应(PCR，30个循环；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s)。然后，用AxyPrepPCR清洁试剂盒，去除上述反应液中其他成分，而获得纯化的启动子Pblma、Pnpu和Pαgly。(2)古细菌S.marinusF1淀粉普鲁兰酶SMApu基因的克隆以古细菌S.marinusF1基因组DNA(100ng，2μL)为模板，加入dNTP(2.5mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌含有Pblma、Pnpu或Pαgly启动子和古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因，所述的Pblma、Pnpu或Pαgly启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，所述的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu编码基因如核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌含有Pblma、Pnpu或Pαgly启动子和古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因，所述的Pblma、Pnpu或Pαgly启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示，所述的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu编码基因如核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，李晓磊，费腾，王勇，裴晶莹，赵佳慧，
申请(专利权)人：长春大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22