三角枫的组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种三角枫的组织培养方法，包括筛选茎段、叶片培养最佳的消毒方案、筛选最适宜三角枫茎段萌芽生长的启动培养基、筛选最适宜三角枫生根培养基等步骤。本发明专利技术的三角枫的组培方法具有污染率低、启动效果高、繁殖率高、组培苗健壮等优点；与现有技术相比，启动培养的嫩梢诱导率提高了60％，完成了增殖生根组培苗生产全过程。

【技术实现步骤摘要】
三角枫的组织培养方法
本专利技术涉及植物组培方法，尤其涉及一种三角枫的组织培养方法。
技术介绍
三角枫(Acerbuergerianum)属槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)落叶乔木，别名三角槭。春叶嫩红，秋叶暗红或橙红，观赏效果颇佳，常以桩景树、庭荫树的形式出现在园林景观中，是我国优良的乡土树种之一。三角枫可做为彩叶树种推广，具有广阔的发展前景。随着组培技术的发展，组培为三角枫的快速繁殖和工厂化生产提供了一条有效途径。目前国内三角枫的繁殖方式主要以播种为主。播种繁殖周期长且性状分离严重，长势参差不齐，不利于工厂化、产业化。利用离体培养可以快速繁殖优良单株，且保持树体稳定性，还可以缩短培育年限，打破季节的限制，能够大大提高三角枫的生产速率。国内学者对槭属植物主要集中在五角枫、美国红枫、鸡爪槭等的组培快繁研究，但对于三角枫组培快繁研究报道却寥寥无几。对于三角枫的快繁，目前李彬等研究了其嫁接和扦插技术。对于三角枫的组织培养技术，刘玉民等研究了其愈伤组织，以MS为基本培养基，用2，4-D、NAA、6-BA、IBA做激素，发现诱导愈伤组织的最佳激素组合为6-BA1mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1，最适宜的温度为25℃左右。但是目前还没有关于三角枫组培试验生根的报道。同属组培试验成功的案例中所用的基本培养基有WPM，MS，NN69等几种，激素有IBA，6-BA，NAA，IAA，TDZ等。除此之外，在培养过程中，关于光照强度，光照时长，温度等因素也对外植体的生长有所影响。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供了一种三角枫的组织培养方法，填补了关于三角枫组培试验生根技术的空缺，解决了现有技术中心三角枫播种繁殖周期长且性状分离严重，长势参差不齐，不利于工厂化、产业化的问题。技术方案：本专利技术的三角枫的组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体的采集，于3-5月份晴天的中午，采集当年生枝条的中上部带腋芽茎段。(2)外植体预处理，将步骤(1)中采集的的枝条剪成1-2cm带腋芽的茎段，叶片修剪成方形，并将修剪的茎段和叶片放入洗衣粉的饱和溶液中浸泡10-20min，优选15min，后用自来水冲洗干净，然后再将茎段和叶片放入农药中浸泡7-12min，优选10min，后并用流水冲洗1.5-2.5h，优选2h。(3)茎段表面消毒，将步骤(2)中冲洗完毕的外植体转入超净工作台进行进一步的消毒处理，消毒处理完成后，然后将外植体沥干水分，并对其两端进行适当的修剪，并形态学朝上接种在供试培养基上。(4)叶片表面消毒，将步骤(2)中预处理好的叶片转入超净工作台进一步的消毒处理，沥干水后，然后将叶片适当修剪并垂直于叶片的叶脉进行刻伤，背面紧贴培养基接入；(5)启动培养，将步骤(3)经过消毒灭菌的外植体两端切口处修剪成1-1.5cm的单芽茎段，直立式接种于启动培养基上；(6)茎段处理，选择L9(34)的正交设计，设置3个因素，每个因素3个水平，每种处理均加入7.1g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，并控制PH5-6.5；优选5.8。(7)初代培养环境，将步骤(5)中接种好的单芽茎段在温度为22-25℃、光照周期为12h光照12h黑暗、光照强度为2000lx的条件下放置在无菌培养室中培养20-30d，优选25d，叶片诱导愈伤组织则先进行暗培养3d，然后与单芽茎段培养的环境相同；(8)增殖培养，将步骤(7)中培养的组培苗截取成1-2cm左右的单芽茎段，优选1.5cm，减去下部较大的能接触到培养基的叶片，垂直接种于增殖培养基中增殖培养15-25d，优选20d。(9)生根培养，选取步骤(8)中增殖培养健壮的组培苗，将基部进行适当修剪后转入生根培养基进行根的诱导。其中，步骤(2)中，所述叶片修剪成6×6mm的正方形。所述农药包括质量百分比为0.1％多菌灵及0.03％链霉素。步骤(3)中，所述茎段表面消毒处理包括步骤：先用75％的酒精消毒30s并不断搅拌，再用无菌水冲洗2-3次，然后用0.1％的升汞浸泡4-12min，最后用无菌水冲洗5-6次。步骤(4)中，叶片表面消毒处理包括步骤：先用75％的酒精消毒30s并不断搅拌，然后用无菌水冲洗2-3次，最后用升汞浸泡1-5min。步骤(5)中，所述启动培养基包括NN69+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，诱导率为71.7％。步骤(6)中，所述3个因素包括培养基、6-BA、NAA，其中所述培养基包括MS、NN69、WPM3个水平，所述6-BA包括0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-13个水平，所述NAA包括0mg·L-1、0.1mg·L-1、0.3mg·L-13个水平。共9个处理，重复三次。叶片激素处理浓度为6-BA(0.1、0.5、1.0mg·L-1)，NAA(0.05、0.1、0.3mg·L-1)。步骤(7)中，还包括每周用75％的酒精给培养室与培养架消毒的步骤。步骤(8)中，增殖培养基包括MS+BA0.3mg·L-1、NAA0.01mg·L-1、GA0.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1琼脂6.5g·L-1，pH值为5.8，增殖系数达4.0，且组培苗生长健壮，节间明显伸长。步骤(9)中，生根培养基包括1/2MS+NAA1.0mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加琼脂7.0g·L-1，pH值为5.8，生根率达90％。有益效果：1、本专利技术的三角枫的组培方法具有污染率低、启动效果高、繁殖率高、组培苗健壮等优点；2、与现有技术相比，启动培养的嫩梢诱导率提高了60％，完成了增殖生根组培苗生产全过程。具体实施方式实施例1三角枫的组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料：取自生长健壮的四年生三角枫，且母株均为实生苗，剪取当年生半木质化且无病虫害的枝条和幼叶。(2)方法：(2-1)外植体的采集：于3-5月份晴天的中午，采集部位为当年生枝条的中上部的带腋芽茎段。(2-2)外植体预处理：将采集好的的枝条剪成带腋芽的小段，长约1-2cm。叶片则修剪成6×6mm的正方形。先将修剪好的茎段和叶片放入高浓度洗衣粉中浸泡15min，之后用自来水冲洗干净。在上一步操作完成后，再将茎段和叶片放入农药(0.1％多菌灵+0.03％链霉素)中浸泡10min并用流水冲洗2h。(2-3)茎段表面消毒：将冲洗好的外植体转入超净工作台进行进一步的消毒处理。先用75％的酒精消毒30s并不断搅拌，再用无菌水冲洗2-3次。接着用0.1％的升汞浸泡4-12min，最后用无菌水冲洗5-6次。消毒处理完成后，将外植体沥干水分，并对其两端进行适当的修剪，然后形态学朝上接种在供试培养基上。(2-4)叶片表面消毒：将预处理好的叶片转入超净工作台，用75％的酒精消毒30s并不断搅拌，接着用无菌水冲洗2-3次，再用升汞浸泡1-5min，沥干水后，将叶片适当修剪并垂直于叶片的叶脉进行刻伤，背面紧贴培养基接入。(2-5)启动培养：将经过消毒灭菌的外植体两端切口处稍做修剪，修剪成1-1.5cm的单芽茎段，直立式接种于启动培养基上，茎段萌芽生长的启动培养基为NN69+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，诱导率为71.7％。(2-6)茎段处理，选择L9(34)的正交设计，设置3个因素，每个因素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三角枫的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的采集，于3‑5月份晴天的中午，采集当年生枝条的中上部带腋芽茎段；(2)外植体预处理，将步骤(1)中采集的的枝条剪成1‑2cm带腋芽的茎段，叶片修剪成方形，并将修剪的茎段和叶片放入洗衣粉的饱和溶液中浸泡10‑20min后用自来水冲洗干净，然后再将茎段和叶片放入农药中浸泡7‑12min后并用流水冲洗1.5‑2.5h；(3)茎段表面消毒，将步骤(2)中冲洗完毕的外植体进行进一步的消毒处理，然后对其两端进行修剪，并形态学朝上接种在供试培养基上；(4)叶片表面消毒，将步骤(2)中预处理好的叶片进一步的消毒处理，然后将叶片修剪并垂直于叶片的叶脉进行刻伤，背面紧贴培养基接入；(5)启动培养，将步骤(3)经过消毒灭菌的外植体两端切口处修剪成1‑1.5cm的单芽茎段，直立式接种于启动培养基上；(6)茎段处理，选择正交设计，设置3个因素，每个因素3个水平，每种处理均加入7.1g·L‑1琼脂，30g·L‑1蔗糖，并控制PH 5‑6.5；(7)初代培养环境，将步骤(5)中接种好的单芽茎段在温度为22‑25℃、光照周期为12h光照12h黑暗、光照强度为2000lx的条件下无菌培养20‑30d，叶片诱导愈伤组织则先进行暗培养3d，然后与单芽茎段培养的环境相同；(8)增殖培养，将步骤(7)中培养的组培苗截取成1‑2cm的单芽茎段，垂直接种于增殖培养基中增殖培养15‑25d；(9)生根培养，选取步骤(8)中增殖培养健壮的组培苗，将基部修剪后转入生根培养基进行根的诱导。...

【技术特征摘要】
1.一种三角枫的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的采集，于3-5月份晴天的中午，采集当年生枝条的中上部带腋芽茎段；(2)外植体预处理，将步骤(1)中采集的的枝条剪成1-2cm带腋芽的茎段，叶片修剪成方形，并将修剪的茎段和叶片放入洗衣粉的饱和溶液中浸泡10-20min后用自来水冲洗干净，然后再将茎段和叶片放入农药中浸泡7-12min后并用流水冲洗1.5-2.5h；(3)茎段表面消毒，将步骤(2)中冲洗完毕的外植体进行进一步的消毒处理，然后对其两端进行修剪，并形态学朝上接种在供试培养基上；(4)叶片表面消毒，将步骤(2)中预处理好的叶片进一步的消毒处理，然后将叶片修剪并垂直于叶片的叶脉进行刻伤，背面紧贴培养基接入；(5)启动培养，将步骤(3)经过消毒灭菌的外植体两端切口处修剪成1-1.5cm的单芽茎段，直立式接种于启动培养基上；(6)茎段处理，选择正交设计，设置3个因素，每个因素3个水平，每种处理均加入7.1g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，并控制PH5-6.5；(7)初代培养环境，将步骤(5)中接种好的单芽茎段在温度为22-25℃、光照周期为12h光照12h黑暗、光照强度为2000lx的条件下无菌培养20-30d，叶片诱导愈伤组织则先进行暗培养3d，然后与单芽茎段培养的环境相同；(8)增殖培养，将步骤(7)中培养的组培苗截取成1-2cm的单芽茎段，垂直接种于增殖培养基中增殖培养15-25d；(9)生根培养，选取步骤(8)中增殖培养健壮的组培苗，将基部修剪后转入生根培养基进行根的诱导。2.根据权利要求1所述的三角枫的组织培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述叶片修剪成6×6mm的正方形。3.根据权利要求1所述的三角枫的组织培养方法，其特征在于：步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国华，王永平，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32