一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种酶标仪酶法定量检测乳果糖的方法及其试剂盒。本发明专利技术采用果糖建立标准曲线，解决了酶标仪检测中无法定量的技术问题，使检测方法因采用酶标仪而极大的提高的检测效率，降低了检测试剂用量。另一方面，本发明专利技术通过将葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶，NADP

【技术实现步骤摘要】
一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种采用酶标仪利用酶化学法定量测定液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒，属于酶化学分析检测领域。
技术介绍
乳果糖是乳糖在牛奶热处理过程中发生碱基异构的产物，与乳糖是同分异构体，是评估牛奶热处理程度的一项重要指标。欧盟和IDF均提议UHT灭菌乳的乳果糖含量不得超过600mg/L。因此，乳果糖的准确测定十分重要。目前，国内外关于液态奶中乳果糖的检测方法都比较复杂，一般为高效液相色谱法和基于酶分析的分光光度法。其中高效液相色谱法因样品中乳糖含量高于乳果糖的数十倍，在分离中乳糖与乳果糖间很难达到基线分离，从而使定量检测乳果糖存在较大难度。基于酶分析的分光光度法则是采用标准摩尔吸光系数定量的方法(例如在NY/T939-2016和ISO11285-2004等标准中记载的酶分析分光光度法)，存在样品处理繁琐、测定时需采用比色皿分别进行测定、检测通量小、耗时长的问题，在大批量样品测定中该问题更为突出。另外，酶分析分光光度法，整个测定过程中使用的酶的种类较多，需分别进行配制，酶试剂用量大，不但检测成本高，且酶活性难以保障，直接影响测定结果。随着近年来酶标仪测定技术的不断成熟，运用酶标仪提高检测通量，降低检测成本，可能成为测定乳果糖的一种新途径，但是如何去除乳糖的干扰，对乳果糖进行准确定量仍然是一道难题。
技术实现思路
针对目前使用的酶分析分光光度法定量检测液态奶中乳果糖，测定步骤繁琐、检测效率低、检测成本高，对操作人员技术要求高，须经较长时间的专门培训才可独立操作等缺点，开发了利用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，以及相应的检测试剂盒。本专利技术所利用的酶化学原理，与标准的分光光度法测定液态奶中乳果糖含量所用的酶化学原理相同，故标准NY/T939-2016全文引用在本专利技术中作为参考。在采用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖含量的方法中，酶标仪无法采用分光光度计法的朗伯比尔定律定量的方法，需要建立新的定量手段。经过研究考察，本专利技术的专利技术人采用果糖为标准品，建立果糖的标准曲线，用于酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的含量，不仅解决了酶标仪法测量中无法定量的技术问题，还避免了采用其他物质为标准品，例如，以乳果糖为标准品，需经多个步骤酶解带来的方法学误差。本专利技术的第一个方面是，提供一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线。根据本专利技术，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP+和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。优选，在微孔板中的4-10个孔中加入果糖标准品溶液。优选，每孔中的果糖质量以μg为单位。优选，每孔中的果糖质量依次呈等差增长，例如，以0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔的间距增长，或以0、2.0、4.0、6.0μg/孔的间距增长。在本专利技术的一个具体实施方式中，在7个孔中加入果糖标准品溶液，使孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔。优选，每孔中的果糖质量依次呈倍数增长，例如，可以是呈2倍、3倍、4倍等倍数增长。在本专利技术的一个具体实施方式中，在4个孔中加入果糖标准品溶液，使孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、4.0μg/孔。优选，NADP+和ATP以NADP+和ATP的混合液形式加入，所述混合液中，NADP+的浓度为7-12mg/mL，ATP的浓度为40-60mg/mL。优选，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合悬浮液的形式加入，所述悬浮液中己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。优选，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后放于37℃下反应10min。优选，磷酸葡萄糖异构酶溶液的浓度为700-900U/mL。优选，加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后于37℃下反应15min。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述果糖标准曲线的建立步骤为：在微孔板中加入果糖标准品溶液，使果糖质量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔，加入缓冲液B(140.0g/L三乙醇胺盐酸盐、2.5g/L硫酸镁，pH7.5～7.7)、NADP+和ATP混合液后混匀放置；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，混匀后放于37℃下反应10min后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀放于37℃下反应15min后，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，果糖质量(μg/孔)为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。根据本专利技术，所述检测方法还包括，检测奶样的(A2-A1)的值，根据果糖标准曲线换算出奶样中乳果糖的含量。根据本专利技术，所述换算公式为：式中：X：样品中乳果糖含量，单位为mg/L；C：由标准曲线或回归方程计算得到的奶样微孔中果糖含量，单位为μg；f：转换系数；V1：检测开始时吸取的奶样体积，单位为mL，数值可以为0.3-1。在本专利技术的一个实施方式中，其数值为0.50，即检测开始时吸取的奶样体积为0.50mL。V2：样品前处理过程中沉淀样品中脂肪和蛋白质离心后的体积，单位为mL，数值可以为1.2-4，在本专利技术的一个实施方式中，其数值为2.00，即沉淀离心后的体积为2mL。V3：吸取离心后上清液的体积，单位为mL，数值可以为0.3-1，优选和V1的数值相同。在本专利技术的一个实施方式中，其数值为0.50，即，吸取离心后上清液的体积为0.50mL。V4：葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积，单位为mL，数值可以为0.606-2.02，在本专利技术的一个实施方式中，其数值为1.01，即，葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积为1.01mL。V5：进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积，单位为mL，数值可以是0.06-0.2，在本专利技术的一个实施方式中，其数值为0.10，即，进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积为0.10mL。ML：乳果糖的摩尔质量，342.3g/molMF：果糖的摩尔质量，180.16g/mol所述转换系数f，根据检测过程中对应步骤液体的体积数，会发生相应变化，在本专利技术的一个实施方式中，根据对应步骤的液体体积数计算出的转换系数f＝153.52。本专利技术的检测方法，还进一步包括样品前处理步骤。根据本专利技术，所述样品前处理步骤包括：采用硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀液态奶样品中的蛋白与脂肪，离心后，取上清液，加入β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖，然后加入葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖。优选，所述硫酸锌溶液的浓度为168g/L。优选，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为130g/L。优选，所述β-半乳糖苷酶溶液的浓度为(1.5-3.0)×103U/mL。优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP+和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2‑A1)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程；优选，在微孔板中的4‑10个孔中加入果糖标准品溶液；优选，每孔中的果糖质量以μg为单位；优选，每孔中的果糖质量依次呈等差增长；更优选，孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔；优选，每孔中的果糖质量依次呈倍数增长。

【技术特征摘要】
1.一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP+和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程；优选，在微孔板中的4-10个孔中加入果糖标准品溶液；优选，每孔中的果糖质量以μg为单位；优选，每孔中的果糖质量依次呈等差增长；更优选，孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔；优选，每孔中的果糖质量依次呈倍数增长。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括检测奶样的(A2-A1)的值，根据果糖标准曲线换算出奶样中乳果糖的含量，所述换算公式为：式中：X：样品中乳果糖含量，单位为mg/L；C：由标准曲线或回归方程计算得到的奶样微孔中果糖含量，单位为μg；f：转换系数；V1：检测开始时吸取的奶样体积，单位为mL；V2：样品前处理过程中沉淀样品中脂肪和蛋白质离心后的体积，单位为mL；V3：吸取离心后上清液的体积，单位为mL；V4：葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积，单位为mL；V5：进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积，单位为mL；ML：乳果糖的摩尔质量，342.3g/molMF：果糖的摩尔质量，180.16g/mol。3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括样品前处理步骤，所述样品前处理步骤包括：采用硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀液态奶样品中的蛋白与脂肪，离心后，取上清液，加入β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖，然后加入葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖；优选，所述硫酸锌溶液的浓度为168g/L；优选，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为130g/L；优选，所述β-半乳糖苷酶溶液的浓度为(1.5-3.0)×103U/mL；优选，β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖的反应条件为50℃培养箱或水浴1h；优选，所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL；优选，所述过氧化氢酶溶液的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL；优选，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制成混合酶溶液使用，其中葡萄糖氧化酶的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL，过氧化氢酶的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL；优选，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖的反应条件为40℃培养箱或水浴培养3h。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括样品测定步骤，所述样...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑楠，文芳，李松励，李慧颖，张养东，赵圣国，王加启，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11