基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法技术

本发明专利技术基于聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)构建了一种肌氨酸电化学检测方法，实现复杂样品中肌氨酸的检测。首先对玻碳电极(GCE)进行预处理，将二甲基甲酰胺(DMF)溶液作为溶剂制备PAA溶液，并进行超声处理，然后将上述溶液沉积在GCE表面，并在室温下干燥过夜，随后将均匀分散的戊二醛溶液滴加到上述GCE表面，并在25℃下干燥2小时以形成膜，最后，将SOX溶液滴在改性的GCE上形成SOX层，用于肌氨酸的检测。PAA是具有阳离子络合性质的聚合物，由于其羧基作用，可以作为还原剂来提高该电化学方法的灵敏度，从而实现对肌氨酸的灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种肌氨酸电化学检测方法，更具体地，涉及一种基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法。
技术介绍
前列腺癌(PCa)是男性中的常见癌症，具有递增的发生率以及高的转移和复发风险。前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95％以上，因此，通常我们所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。家族遗传型前列腺癌患者发病年龄稍早，年龄≤55岁的患者占43％。因此，其早期检测对于提高存活率是至关重要的。目前，游离前列腺特异性抗原(fPSA)的百分比是诊断PCa患者的唯一诊断指标。然而，由于fPSA的低浓度和短半衰期，它经常导致假阴性测试结果。最近的研究表明，肌氨酸在前列腺癌患者细胞和尿液中均有增高，肌氨酸诊断PCa的准确率高于fPSA。更重要的是，肌氨酸可以容易地在尿中检测到。这种行为使肌氨酸成为PCa临床诊断的一种非侵入性检测。当前肌氨酸的检测方法主要包括两种。一种是肌氨酸的直接测定，其通常包括色谱法和质谱法。上述技术的主要缺点是仪器成本高、操作复杂，这不适合于临床诊断。另一种是间接定量，其可以通过检测由肌氨酸氧化酶(SOX)和肌氨酸反应产生的H2O2来实现，包括比色法，荧光计和电化学方法。其中，电化学方法由于其操作简单，灵敏度高，选择性高等优点，备受关注。目前已有一些关于肌氨酸的检测方法专利，如中国专利200910265395.7公开了一种肌氨酸的检测方法，该方法包括：向毛细管中注入运行缓冲液，并向所述毛细管内注入样品溶液，在所述毛细管两端施加电压，进行毛细管电泳电化学发光检测。该专利技术选择吡啶钌系衍生物作为发光试剂，并优选使用具有高灵敏度和高稳定性的联吡啶钌，通过简单的仪器，实现了对肌氨酸高效、快速地检测，并且此种方法较色谱-质谱联法相对便宜，但该专利技术可检测的样品溶液仅限被稀释的肌氨酸溶液，无法实现对复杂样品中肌氨酸的检测。因此，本专利技术旨在提供一种肌氨酸的电化学检测方，该法方法可实现对复杂样品中的肌氨酸进行电化学检测，并且具有显著的灵敏度。
技术实现思路
为解决
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术提供一种肌氨酸的电化学检测方法，具体地，是一种基于聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)的肌氨酸电化学检测方法，以实现对复杂样品中的肌氨酸进行电化学检测，并且具有显著的灵敏度。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：(1)聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)在玻碳电极(GCE)上的固定化1)将二甲基甲酰胺(DMF)溶液作为溶剂制备聚酰胺酸(PAA)溶液，并将聚酰胺酸(PAA)溶液超声处理至PAA完全溶解，得超声处理后的聚酰胺酸(PAA)溶液；2)将步骤1)得到的聚酰胺酸(PAA)溶液沉积在玻碳电极(GCE)表面，并在室温下干燥过夜,得到PAA修饰的玻碳电极(GCE)；3)将均匀分散的2.5％戊二醛溶液滴加到步骤2)得到的玻碳电极(GCE)表面，并在25℃下干燥2小时以在GCE表面形成膜；4)将肌氨酸氧化酶(SOX)溶液滴在步骤3)得到的玻碳电极(GCE)表面上，并在4℃下过夜以在GCE表面形成肌氨酸氧化酶(SOX)层；(2)电化学检测用计时电流法在含有不同浓度肌氨酸的0.5MPBS(pH7.2)中进行，起始电位为-0.4V，滴样间隔时间为150s；用电化学阻抗谱(ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy，简称EIS)在含有0.1MKCl的5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行，频率为10-104Hz。进一步地，所述的步骤(1)-1)中制备的聚酰胺酸(PAA)浓度为3-5mg/mL，优选地，所述的聚酰胺酸(PAA)浓度为4mg/mL。进一步地，所述的步骤(1)-1)中超声处理时间为20-40分钟，优选地，所述的超声时间为30分钟。进一步地，所述的步骤(1)-2)中沉积在玻碳电极(GCE)表面的聚酰胺酸(PAA)溶液的体积为3-6μL，优选地，所述的聚酰胺酸(PAA)体积为5μL。进一步地，所述的步骤(1)-3)中将滴加到改性的玻碳电极(GCE)表面的2.5％戊二醛溶液体积为3-6μL，优选地，所述的2.5％戊二醛溶液体积为5μL。进一步地，所述的步骤(1)-4)中将滴加到玻碳电极(GCE)表面上的肌氨酸氧化酶(SOX)溶液体积为3-6μL，优选地，所述的肌氨酸氧化酶(SOX)溶液体积为5μL。进一步地，所述的步骤(1)-4)中肌氨酸氧化酶(SOX)溶液浓度为1mg/mL。本专利技术基于聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)构建了一种肌氨酸电化学检测方法，实现复杂样品中肌氨酸的检测(原理如附图1所示)。肌氨酸的定量检测是通过由SOX催化分解肌氨酸产生的H2O2的电化学检测来实现的，肌氨酸分解产生的H2O2可以氧化PAA的羧酸基团以形成过氧酸基团，PAA是具有阳离子络合性质的聚合物，由于其羧基作用，可以作为还原剂来提高该电流型生物电化学方法的灵敏度。本专利技术构建的电化学检测方法在检测生物样品中表现出优异的分析性能，显示出显著的潜在临床应用价值。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术可实现对复杂样品中的肌氨酸进行电化学检测，并且具有显著的灵敏度。(2)本专利技术中的检测方法在检测生物样品中表现出优异的分析性能，显示出较大的潜在临床应用价值。(3)为前列腺癌的无创、早期诊断提供了新方法和新思路。附图说明图1为本专利技术肌氨酸的电化学检测的原理图。图2为实验例1中的扫描电镜图。图3为实验例1中的电化学交流阻抗图谱图4为实验例2中对实验条件的优化结果图。图5为实施例3中的肌氨酸电化学检测结果图。图6为实验例3中的重现性和特异性实验结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细说明，但是本专利技术的保护范围并不仅局限于此。所用的材料和仪器：聚酰胺酸(PAA)，戊二醛(25％)，氯化铵，肌氨酸，肌酐，尿素，二甲基甲酰胺(DMF)和来自芽孢杆菌的肌氨酸氧化酶(冻干粉末，20-48单位/mg)购自Sigma-Aldrich公司；所有的化学品都是分析纯的，不经进一步纯化使用；在整个专利技术中使用超纯水(25℃下电导率>18MV.cm)；用0.1MNaHPO4和0.1MNa2PO4制备pH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。使用CHI660D电化学工作站(上海晨华仪器有限公司)进行循环伏安法(CV)，计时电流法和电化学阻抗谱(EIS)。在JEOL-1200EXSEM(日本)和HitachiX-650(日本)上进行扫描电子显微镜(SEM)。实施例1聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)玻碳电极(GCE)上的固定化对玻碳电极(GCE，直径3mm)进行预处理，首先将甲基甲酰胺(DMF)溶液作为溶剂制备浓度为4mg/mL的聚酰胺酸(PAA)溶液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)在玻碳电极(GCE)上的固定化1)将二甲基甲酰胺(DMF)溶液作为溶剂制备聚酰胺酸（PAA）溶液，并将聚酰胺酸（PAA）溶液超声处理至PAA完全溶解，得超声处理后的聚酰胺酸(PAA)溶液；2)将步骤1）得到的聚酰胺酸(PAA)溶液沉积在玻碳电极(GCE)表面，并在室温下干燥过夜,得到PAA修饰的玻碳电极（GCE）；3）将均匀分散的2.5％戊二醛溶液滴加到步骤2）得到的PAA修饰的玻碳电极(GCE)表面，并在25℃下干燥2小时以在GCE表面形成膜；4）将浓度为1 mg/mL的肌氨酸氧化酶(SOX)溶液滴在步骤3）得到的玻碳电极(GCE)表面，并在4℃下过夜以在GCE表面形成肌氨酸氧化酶(SOX)层；（2）电化学检测用计时电流法在含有不同浓度肌氨酸的0.5M PBS中进行，起始电位为‑0.4V，滴样间隔时间为150 s，其中，0.5M PBS的pH为7.2；用电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy，简称EIS)在含有0.1M KCl的5.0mM [Fe(CN)6]3‑/4‑ 溶液中进行，频率为10‑104Hz。...

【技术特征摘要】
1.一种基于聚酰胺酸和肌氨酸氧化酶的肌氨酸电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）聚酰胺酸(PAA)和肌氨酸氧化酶(SOX)在玻碳电极(GCE)上的固定化1)将二甲基甲酰胺(DMF)溶液作为溶剂制备聚酰胺酸（PAA）溶液，并将聚酰胺酸（PAA）溶液超声处理至PAA完全溶解，得超声处理后的聚酰胺酸(PAA)溶液；2)将步骤1）得到的聚酰胺酸(PAA)溶液沉积在玻碳电极(GCE)表面，并在室温下干燥过夜,得到PAA修饰的玻碳电极（GCE）；3）将均匀分散的2.5％戊二醛溶液滴加到步骤2）得到的PAA修饰的玻碳电极(GCE)表面，并在25℃下干燥2小时以在GCE表面形成膜；4）将浓度为1mg/mL的肌氨酸氧化酶(SOX)溶液滴在步骤3）得到的玻碳电极(GCE)表面，并在4℃下过夜以在GCE表面形成肌氨酸氧化酶(SOX)层；（2）电化学检测用计时电流法在含有不同浓度肌氨酸的0.5MPBS中进行，起始电位为-0.4V，滴样间隔时间为150s，其中，0.5MPBS的pH为7.2；用电化学阻抗谱(ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy，简称EIS)在含有0.1MKCl的5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行，频率为10-104Hz。2.如权利要求1所述的肌氨酸电化学检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金龙，张永臣，时瑞，滕晓燕，胡琴琴，
申请(专利权)人：南京市第二医院江苏省传染病医院，南京市公共卫生医疗中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32