一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，本发明专利技术使用直接购买的OPA，通过原位反应，实现了对3种常见而难以区分的硫醇分子的检测(Cys、Hcy和GSH)，以及检测体系中，三甲基十六烷基溴化铵(CTAB)的加入有效增强了OPA对3种硫醇分子的荧光响应灵敏度。并且本发明专利技术方案可运用于细胞内硫醇分子的检测及生物成像，同时避免了繁琐复杂的有机合成步骤。本发明专利技术公开的识别生物硫醇分子的方法不仅操作简便，而且原料生物毒性低、结构简单、易得，极具市场应用与推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法
本专利技术属于硫醇分子检测
，涉及一种用于区分响应半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的方法策略，尤其涉及一种基于原位反应的识别策略。本专利技术同时还涉及OPA检测细胞内硫醇分子的应用。
技术介绍
众所周知，小分子硫醇类化合物在生物体系内扮演着举足轻重的角色。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是生物体内常见的三种小分子硫醇化合物，因其具有相似的结构与物理化学性质，难以实现对三者的有效区分。另一方面，现如今荧光探针因其高灵敏度及高分辨度，被认为是一种高效的可以特异性检测及时跟踪监测生物细胞或组织内样品可视化的一种分析方法。因此，开发一种简单而又高效的荧光探针，可以在水相、有机相、细胞内特异性且高分辨率的区分三种硫醇类底物的可行性已得到充分验证，其工作的重要性自不言而喻。在过去十年中，由于分子探针结构简单和非侵入的特性，大量的活细胞中检测巯基的荧光探针已被开发出来。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)作为难以区分且重要的生物硫醇，是其中重要的研究课题之一。在已报道的硫醇化合物的探针中，我们可以看到有很多具备创新型和巧妙思路的设计。尽管如此，利用探针完全区分三种硫醇的测试方法仍然非常少见。因此，如何提供一种操作简便且高效检测生物硫醇分子的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，所述方法具体包括如下步骤：步骤一：在比色管中加入磷酸缓冲溶液，并以所述磷酸缓冲溶液作为溶剂；步骤二：向步骤一的溶剂中加入OPA的二甲基亚砜溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并分别运用紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。通过采用上述技术方案，本专利技术的有益效果如下：本专利技术所使用的探针分子邻苯二甲醛(OPA)具备生物毒性低、结构简单、原位识别、零背景的检测优点，可以实现对目前难以区分的三种硫醇分子的识别响应(Cys、Hcy和GSH)。其中，反应型探针OPA为直接购置产品，其结构式为：OPA通过与硫醇分子的原位反应生成1-烷硫基-2-烷基取代异吲哚结构，硫醇分子结构的差异直接导致生成产物的荧光性质，从而成为一种高灵敏度、高区分度的硫醇分子识别策略。另外，专利技术人通过核磁共振氢谱和高分辨质谱等手段进行表征，证实OPA对3种硫醇分子的检测基于原位反应生成的新荧光团。其识别检测机理如下所示：本专利技术公开的以探针OPA与含有氨基硫醇分子的click反应作为基本作用机制，并以反应生成的1-烷硫基-2-烷基取代异吲哚结构作为荧光信号报告基团，3种硫醇分子所引起的荧光信号差异与其分子结构相关，从而达到生理条件下对3种硫醇分子同时响应并可获得有效区分。优选的，在上述一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法中，所述步骤二还可以用以下步骤替代：向步骤一的溶剂中依次加入OPA的二甲基亚砜溶液、CTAB溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并通过紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。本专利技术通过生理环境中主客体间的原位反应检测策略，有效避免了繁琐的有机合成制备步骤。并且本专利技术通过表面活性剂CTAB的加入，提高OPA对3种硫醇分子的检测灵敏度及响应区分度。其中，所述表面活性剂CTAB为直接购买获得，其结构式为：优选的，在上述一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法中，将所述磷酸缓冲溶液的pH值控制在7～8之间。本专利技术中的磷酸缓冲溶液采用常规的制备方法制备，且专利技术人通过创造性试验将磷酸缓冲溶液的pH控制在7～8之间，实验发现若磷酸缓冲溶液的pH低于7时，酸性条件不利于巯基的加成，难以反应形成荧光物质；相反若磷酸缓冲溶液的pH高于8时，巯基可与生成的荧光物质进一步发生加成反应，致使荧光降低。优选的，所述磷酸缓冲溶液的pH值为7.4。优选的，在上述一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法中，将所述CTAB溶液的浓度控制在0.5～2.5×10-3mol·L-1之间，若CTAB浓度较低时，溶液中难以形成胶束或形成的胶束量少，不利于荧光增强；若CTAB浓度太高则对细胞具有较大毒性，不利于活细胞中的检测。优选的，CTAB参与反应产生最强荧光的最适浓度为1.0×10-3mol·L-1。优选的，OPA与CTAB光谱溶液中的最佳浓度分别为5×10-4mol·L-1和2×10-4mol·L-1。优选的，在上述一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法中，所述生物硫醇分子包括半胱氨酸、高半胱氨酸或谷胱甘肽。本专利技术所述的半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽为目前难以区分的三种硫醇分子，OPA通过与硫醇分子的原位反应，生成1-烷硫基-2-烷基取代异吲哚结构，硫醇分子结构的差异直接导致生成产物的荧光性质，从而成为一种高灵敏度、高区分度的硫醇分子识别策略。优选的，在上述一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法中，所述识别方法在细胞中同时检测生物硫醇分子的具体应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本实验共需2个细胞状态良好的培养皿，分别标记为培养皿1、培养皿2。培养皿1：20μL5×10-4mol·L-1的巯基消除剂N-乙基马来酰亚胺(NEM，孵育30min)→2μL5×10-5mol·L-1OPA溶液(孵育30min)→4μL5×10-4mol·L-1的CTAB溶液(孵育2min)→移除培养液，并加入2mL新鲜细胞培养液→8μL5×10-5mol·L-1Cys溶液(孵育30min)→聚光共聚焦显微镜观察染色效果。培养皿2：前期使用和培养皿1同样的处理方法，改变硫醇底物由Cys换成相同浓度的5×10-5mol·L-1的Hcy。本专利技术所述的OPA探针在生理环境中能够同时响应3种硫醇分子，且具有很高的区分度。本专利技术所公开的用于检测硫醇分子的方法策略极具市场应用与推广价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术探针OPA(5.00×10-4mol·L-1)在pH为7.4的PBS缓冲溶液中与Cys、GSH和Hcy作用时的紫外可见光谱图。图2附图为本专利技术探针OPA(5.00×10-4mol·L-1)在pH为7.4的PBS缓冲溶液中与Cys、GSH和Hcy作用时的荧光光谱图，激发波长：335nm。图3附图为本专利技术探针OPA(5.00×10-4mol·L-1)在pH为7.4的PBS缓冲溶液中与Cys、GSH和Hcy作用时的图谱。图4附图为本专利技术探针OPA(5.00×10-4mol·L-1)在pH为7.4的PBS缓冲溶液中、CTAB存在下与Cys、GSH和Hcy作用时的紫外可见及荧光光谱变化曲线。图5附图为本专利技术探针OPA(5.00×10-5mol·L-1)对HeLa细胞外源Cys,Hcy和GSH(2.00×10-4mol·L-1)作用的荧光成像，其中CTAB的孵育浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：步骤一：在比色管中加入磷酸缓冲溶液，并以所述磷酸缓冲溶液作为溶剂；步骤二：向步骤一的溶剂中加入OPA的二甲基亚砜溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并分别运用紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：步骤一：在比色管中加入磷酸缓冲溶液，并以所述磷酸缓冲溶液作为溶剂；步骤二：向步骤一的溶剂中加入OPA的二甲基亚砜溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并分别运用紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。2.根据权利要求1所述的一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，其特征在于，所述步骤二还可以用以下步骤替代：向步骤一的溶剂中依次加入OPA的二甲基亚砜溶液、CTAB溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并通过紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，李卓恒，张倩，肖玉哲，丁彩凤，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37