本发明专利技术公开了甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法。本发明专利技术首先将甲基营养型芽孢杆菌NJAU‑Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，再利用Oligo 6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70‑250bp，引物长度为22±2bp，最后通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU‑Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出一对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU‑Z9定量PCR引物。本发明专利技术的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和甲基营养型芽孢杆菌NJAU‑Z9的定量提供方法。
【技术实现步骤摘要】
甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物及其设计方法
本专利技术属于农业微生物领域，涉及对一株具促生和抗病能力甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量PCR特异扩增引物的设计及应用。
技术介绍
促进植物生长和抗病的研究中，已经将大量有益微生物菌剂接种到土壤和根际或与有机肥料结合作为土壤改良剂接种至土壤。然而，功能菌株在土壤和根际环境中的存活在其功能发挥上起着关键作用，因此，有效的定殖是功能菌株促进植物生长和改良土壤微生物生态系统的前提。选择性培养基涂布已经被广泛用来检测或分离环境中的目标微生物，然而，该方法灵敏度较低且耗时，并且对于形态上相似度高的菌种难以准确识别。当前，不依赖于培养的检测方法也被广泛使用，然而，这些方法大多基于16SrRNA基因，但检测水平只能在属和物种水平上提供高度接近的结果，并不足以针对菌株水平的特异检测。基于DNA的定量PCR(qPCR)技术可以准确定量土壤中多种微生物的丰度，已成为当前分子微生物学及微生物生态学研究中的关键技术，其方法主要利用特异引物扩增特异DNA片段，再进一步计算拷贝数，因此，引物设计是qPCR中至关重要的一环。目前常用的引物设计必须首先寻找到具有特异性的序列，通常的做法是，从文献中获取物种特异性基因，并根据其保守性确定其实用性，然而，从文献中获得的所谓“物种特异性基因”往往信息比较滞后，并未基于不断增长的基因组数据进行必要的更新，导致获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。近些年来，全基因组测序已成为研究生物体综合信息的快速且经济有效的方法。基因组序列可提供菌种最高分辨率的遗传信息，且能够通过其与数据库的比对，获得菌株特异性遗传标记。本专利技术提出一种基于一株多功能根际促生菌株甲基营养型芽孢杆菌的全基因组序列(WGS)与全权威数据库比对，获得该菌株特异性基因片段区域，并开发出其特异性定量PCR引物的设计方案。进而利用此特异性引物，开发出了该菌株的定量PCR方法，并利用本专利技术有效探究了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9在植物根系的动态变化，以揭示其在农业生产实践的潜在促生机制。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有实时定量PCR特异性引物设计技术的局限，提供一种基于全基因组上的特异性片段设计菌株特异性定量PCR引物的方法。本专利技术同时提供了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的菌株特异性定量PCR引物。本专利技术同时还提供了甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量PCR方法。一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)NJAU-Z9(该菌株通过16SrRNA序列鉴定分析为甲基营养型芽孢杆菌，通过基因组比对为B.methylotrophicus同义词B.velezensis，在此我们依然保留16SrRNA序列鉴定分析命名甲基营养型芽孢杆菌)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCCNO.12342。全基因组序列比对设计甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物的方法包括如下步骤：(1)将菌株NJAU-Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段。(2)利用Oligo6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22±2bp，共设计8对引物。(3)通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU-Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出如下一对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR引物；P4：Z9-4F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA和Z9-4R：AAGTAACCTCTTTACCCACA。按照所述的方法设计的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物，其特征在于引物序列如下：P4：Z9-4F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA(SEQIDNO.9)和Z9-4R：AAGTAACCTCTTTACCCACA(SEQIDNO.10)；P3：Z9-3F:GTGGTAGTAACGCTATTGAA(SEQIDNO.7)和Z9-3:CCTCTTTACCCACAACTGCA(SEQIDNO.8)。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR特异性引物中的任意一对在制备甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9定量PCR试剂盒中的应用。有益效果本专利技术的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量提供方法，该方法设计的一对引物用于甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9的定量特异性好、准确度高。附图说明图1设计的8对引物(P1到P8)对NJAU-Z9基因组DNA的普通PCR扩增图2基于甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9基因组设计的8对引物对不同芽孢杆菌属菌株的交叉扩增结果。条带M：DL2000DNA标记；条带1：甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9；条带2：枯草芽孢杆菌NJAU-G10；条带3：解淀粉芽孢杆菌SQR-9；条带4：解淀粉芽孢杆菌T-5；条带5：短小芽孢杆菌LZ-8；6：解淀粉芽孢杆菌NJN-6；条带7：死谷芽孢杆菌NJAU-N23。引物1-8是根据NJAU-Z9基因组序列设计的潜在特异引物；“Bacillus”，芽孢杆菌属通用引物为阳性对照。图3qPCR和平板计数(PL)法在添加菌株NJAU-Z9的灭菌和非灭菌土壤中立即和5天后检测的结果。字母表示通过Tukey检验引物之间的显着差异图4甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9对辣椒种苗及盆栽辣椒的促生效果图5第一季盆栽试验中辣椒不同生育期根际土中NJAU-Z9的定量PCR测定结果图6第二季盆栽试验中菌株NJAU-Z9的qPCR定量数据与成熟期植物生长指数间的皮尔森相关性生物材料保藏信息NJAU-Z9,甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCCNO.12342，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。具体实施方式实施例1供试菌株来源本专利技术中所实验的甲基营养型芽孢杆菌NJAU-Z9(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCCNO.12342)及6株同属芽孢杆菌属的相近的菌株，所有菌保存于南京农业大学江苏固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室(表1)，全基因组序列上传于NCBI生物技术信息中心登录号NZ_CP022556.1。表1用于引物分析的菌株及其相应的GenBank登录号实施例2引物序列选择及交叉扩增验证试验本专利技术基于全基因组序列在数据库中进行比对，搜索针对NJAU-Z9的特异性序列。第一步：将NJAU-Z9全基因组序列(NZ_CP022556.1.)在NCBI和EzTaxon两大权威数据库进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段。第二步：利用Oligo6软件实施引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22±2bp，共设计8对引物(表2)，并将8对引物通过普通PCR对NJAU-Z9基因组DNA依次本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物的设计方法；其特征在于包括如下步骤：(1)将菌株NJAU‑Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段；(2)利用Oligo 6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70‑250bp，引物长度为22物长度bp，共设计8对引物；(3)通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU‑Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出两对最优的甲基营养型芽孢杆菌NJAU‑Z9定量PCR引物。
【技术特征摘要】
1.甲基营养型芽孢杆菌菌种特异性定量PCR引物的设计方法；其特征在于包括如下步骤：(1)将菌株NJAU-Z9全基因组序列在NCBI和EzTaxon数据库中进行比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段；(2)利用Oligo6软件进行引物序列设计，设定产物大小为70-250bp，引物长度为22物长度bp，共设计8对引物；(3)通过与同属不同种菌株依次交叉进行扩增特异性检验，土壤添加NJAU-Z9进行扩增特异性再检测，并结合盆栽土壤...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈其荣，张扬，李荣，张楠，朱成之，刘红军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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