水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法技术

本发明专利技术公开一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，包括：S1进行水生环境提取；S2进行BOX‑PCR；S3进行高斯计算，获得计算结果；本发明专利技术水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法在鉴定前期进行提纯在鉴定后期进行优化计算，大大提高鉴定结果的准确性以及参考性。

【技术实现步骤摘要】
水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法
本专利技术涉及生物鉴定领域，尤其是一种高效准确的水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法。
技术介绍
芽孢杆菌属是大的(4–10um),革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属可分为以下亚群：苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(包括蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、短小芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。细胞呈直杆状，0.5～2.5μm×1.2～10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制。好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。通常接触酶阳性。发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。传统技术中水生环境中芽孢杆菌的鉴定因为取样少或者取样不均匀等问题鉴定的效果比较差。
技术实现思路
本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术包括：S1进行水生环境提取；S2进行BOX-PCR；S3进行高斯计算，获得计算结果；S1包括如下步骤：(S11)取水环境样品，涂抹在倾斜放置的试管内壁，于33摄氏度培养20-22小时，然后取培养好的试管，加入18毫升a1溶液，用接种环将试管上的菌苔轻轻刮下，振荡a1溶液，然后将a1溶液倾注于另一盛有33毫升a1溶液的a2容器中，a2容器中放入四粒培养物质，然后在摇床上以120转/分钟的速度振荡30分钟，制成均匀菌悬液，放置在6摄氏度环境保存备用；(S12)取A生物培养基，并将培养基加入a3容器中，加塞后，进行0.2MP灭菌30分钟，然后将步骤(S11)得到的均匀菌悬液接种到a3容器的培养基中，接种量按3.5％，接种后将a3容器于36摄氏度，振荡30小时，摇床转速为135转/分钟，得到菌种；取B生物培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8分钟，冷却到室温，凝固待用；(S13)将步骤(S12)得到的B生物培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(S12)得到的菌种在平板上进行划线培养，将菌种进行分离、纯化；(S14)将分离、纯化得到的菌种进行培育，采用250升不锈钢发酵罐，高径比为2.5:1.5，装液量75％，培养周期90小时，将步骤(S13)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量8％，罐压0.12-0.15MPa，温度32摄氏度，搅拌转速100-120转/分钟。进一步，所述a1溶液为无菌生理盐水，所述a2容器选择一号三角瓶，所述a3容器选择二号三角瓶；上述培养物质包括以下重量份的原料制备而成：胰酪蛋白胨10份、酵母浸出粉8份、氯化钠15份；酸碱度环境7.2。进一步，所述A生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：peptone6份，牛肉膏5份，氯化钠6份；所述B生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：C6H12O63份、豆芽浸汁26份、酵母浸粉1份；酸碱度环境7.0。进一步，S2步骤：(S21)选取菌种样品，对样品进行预处理，并用机械破碎提取样品中微生物的总基因组DNA；(S22)选择芽孢杆菌的b1基因作为的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的7’端加上b2结构；巢式PCR所用的第一轮芽孢杆菌专一性引物为：p1F，p1R；第二轮针对芽孢杆菌b1区的引物为：p2F，p2R；(S23)以步骤(S21)中的基因组为循环体进行PCR的扩增；(S24)将PCR产物在最适条件下进行电泳分析；(S25)染色后与已知的MAKER比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收；(S26)回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子；(S27)对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行比对、验证；(S28)将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在DNA序列数据库中局部序列比对基本检索工具比对分析获得鉴定数据X。进一步，上述b1是16SrRNAV9区，上述b2是GC发夹。进一步，步骤(S24)中电泳条件为电压100伏特，60℃下电泳200分钟，变性梯度为0.32。进一步，步骤(S25)中染色方法为使用核酸凝胶染料染色三次，每次20分钟；未知条带切胶回收的方法为：优势条带切割后置于灭过菌的2毫升离心管中，加入适量灭菌超纯水清洗，之后参入60μL灭菌超纯水并放置在4摄氏度冰箱静置过夜。进一步，步骤(S26)中PCR扩增采用的引物与步骤(S22)中的引物相同。进一步，步骤(S27)中菌落PCR的引物与与步骤(S22)中的引物相同，并且是将阳性克隆子菌落PCR产物与步骤(S23)中的样品PCR产物进行重新凝胶电泳比对。进一步，S3计算包括：S31采集多组鉴定数据X；S32设置数据统计参数和函数模型：公式中其他参数为高斯模型参数，S33将上述函数拟合后获取最终计算数据X。本专利技术的有益效果是，在鉴定前期进行提纯在鉴定后期进行优化计算，大大提高鉴定结果的准确性以及参考性。具体实施方式在实施例中，本专利技术包括：S1进行水生环境提取；S2进行BOX-PCR；S3进行高斯计算，获得计算结果；S1包括如下步骤：(S11)取水环境样品，涂抹在倾斜放置的试管内壁，于31-35摄氏度培养20-22小时，然后取培养好的试管，加入16-19毫升a1溶液，用接种环将试管上的菌苔轻轻刮下，振荡a1溶液，然后将a1溶液倾注于另一盛有33毫升a1溶液的a2容器中，a2容器中放入四粒培养物质，然后在摇床上以120转/分钟的速度振荡25-35分钟，制成均匀菌悬液，放置在5-8摄氏度环境保存备用。(S12)取A生物培养基，并将培养基加入a3容器中，加塞后，进行0.2MP灭菌30分钟，然后将步骤(S11)得到的均匀菌悬液接种到a3容器的培养基中，接种量按3.5％，接种后将a3容器于36摄氏度，振荡30小时，摇床转速为135转/分钟，得到菌种；取B生物培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8分钟，冷却到室温，凝固待用。(S13)将步骤(S12)得到的B生物培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(S12)得到的菌种在平板上进行划线培养，将菌种进行分离、纯化。(S14)将分离、纯化得到的菌种进行培育，采用250升不锈钢发酵罐，高径比为2.5:1.5，装液量75％，培养周期80-100小时，将步骤(S13)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量8％，罐压0.12-0.15MPa，温度30-35摄氏度，搅拌转速100-120转/分钟；所述a1溶液为无菌生理盐水，所述a2容器选择一号三角瓶，所述a3容器选择二号三角瓶；上述培养物质包括以下重量份的原料制备而成：胰酪蛋白胨10份、酵母浸出粉8份、氯化钠15份；酸碱度环境7.2；所述A生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：peptone6份，牛肉膏5份，氯化钠6份；所述B生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：C6H12O63份、豆芽浸汁26份、酵母浸粉1份；酸碱度环境7.0。S2步骤：(S21)选取菌种样品，对样品进行预处理，并用机械破碎提取样品中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，其特征在于，包括：S1进行水生环境提取；S2进行BOX‑PCR；S3进行高斯计算，获得计算结果；S1包括如下步骤：(S11)取水环境样品，涂抹在倾斜放置的试管内壁，于33摄氏度培养20‑22小时，然后取培养好的试管，加入18毫升a1溶液，用接种环将试管上的菌苔轻轻刮下，振荡a1溶液，然后将a1溶液倾注于另一盛有33毫升a1溶液的a2容器中，a2容器中放入四粒培养物质，然后在摇床上以120转/分钟的速度振荡30分钟，制成均匀菌悬液，放置在6摄氏度环境保存备用；(S12)取A生物培养基，并将培养基加入a3容器中，加塞后，进行0.2MP灭菌30分钟，然后将步骤(S11)得到的均匀菌悬液接种到a3容器的培养基中，接种量按3.5％，接种后将a3容器于36摄氏度，振荡30小时，摇床转速为135转/分钟，得到菌种；取B生物培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8分钟，冷却到室温，凝固待用；(S13)将步骤(S12)得到的B生物培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(S12)得到的菌种在平板上进行划线培养，将菌种进行分离、纯化；(S14)将分离、纯化得到的菌种进行培育，采用250升不锈钢发酵罐，高径比为2.5:1.5，装液量75％，培养周期90小时，将步骤(S13)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量8％，罐压0.12‑0.15MPa，温度32摄氏度，搅拌转速100‑120转/分钟。...

【技术特征摘要】
1.一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，其特征在于，包括：S1进行水生环境提取；S2进行BOX-PCR；S3进行高斯计算，获得计算结果；S1包括如下步骤：(S11)取水环境样品，涂抹在倾斜放置的试管内壁，于33摄氏度培养20-22小时，然后取培养好的试管，加入18毫升a1溶液，用接种环将试管上的菌苔轻轻刮下，振荡a1溶液，然后将a1溶液倾注于另一盛有33毫升a1溶液的a2容器中，a2容器中放入四粒培养物质，然后在摇床上以120转/分钟的速度振荡30分钟，制成均匀菌悬液，放置在6摄氏度环境保存备用；(S12)取A生物培养基，并将培养基加入a3容器中，加塞后，进行0.2MP灭菌30分钟，然后将步骤(S11)得到的均匀菌悬液接种到a3容器的培养基中，接种量按3.5％，接种后将a3容器于36摄氏度，振荡30小时，摇床转速为135转/分钟，得到菌种；取B生物培养基，并将培养基中加入蒸馏水，在电炉上煮沸8分钟，冷却到室温，凝固待用；(S13)将步骤(S12)得到的B生物培养基融化，并涂布于平板上，再将步骤(S12)得到的菌种在平板上进行划线培养，将菌种进行分离、纯化；(S14)将分离、纯化得到的菌种进行培育，采用250升不锈钢发酵罐，高径比为2.5:1.5，装液量75％，培养周期90小时，将步骤(S13)得到的纯化菌种进行摇瓶培养，然后接种，接种量8％，罐压0.12-0.15MPa，温度32摄氏度，搅拌转速100-120转/分钟。2.根据权利要求1所述的一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，其特征在于，所述a1溶液为无菌生理盐水，所述a2容器选择一号三角瓶，所述a3容器选择二号三角瓶；上述培养物质包括以下重量份的原料制备而成：胰酪蛋白胨10份、酵母浸出粉8份、氯化钠15份；酸碱度环境7.2。3.根据权利要求1所述的一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，其特征在于，所述A生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：peptone6份，牛肉膏5份，氯化钠6份；所述B生物培养基包括以下重量份的原料制备而成：C6H12O63份、豆芽浸汁26份、酵母浸粉1份；酸碱度环境7.0。4.根据权利要求1所述的一种水生环境中芽孢杆菌box_pcr快速鉴定方法，其特征在于，S2步骤：(S21)选取菌种样品，对样品进行预处理，并用机械破碎提取样品中微生物的总基因组DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：操玉涛，曹湛慧，杨煊懿，申玉春，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东,44