一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及应用技术

一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：（1）通过三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸钠制备四氧化三铁纳米粒子；（2）制备磁性二氧化硅纳米粒子；（3）制备多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子；（4）通过多巴胺聚合原位包埋制备磁性二氧化硅固定化木质素过氧化物酶；向含有机污染物的废水中加入上述方法制备的固定化木质素过氧化物酶及过氧化氢，室温下反应，以去除有机污染物。本发明专利技术制备工艺简便，采用的固定化载体是纳米级颗粒，安全无毒害，稳定性好，比表面积大，与酶的结合率高，在催化体系中的分散性较好，对污染物的去除效率更高，无二次污染的风险，该固定化载体可以通过磁性分离回收重复利用固定化酶。

【技术实现步骤摘要】
一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及应用
本专利技术涉及一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及其在处理废水中有机污染物方面的应用，属于废水中有机污染物处理

技术介绍
工业和畜禽养殖废水中主要的有机污染物有酚类化合物、苯类化合物、卤烃类化合物和抗生素等。这些有机污染物毒性大且不容易被环境中的微生物降解。目前，处理废水中的有机污染物的方法主要有化学法、物理法和生物法等。其中物理方法一般设备较为昂贵，处理的条件要求高；化学法在处理的过程中见效快，周期短，但容易产生二次污染；生物法则需要大量培养微生物，周期较长且废水中的污染物对微生物的生长产生危害。酶是被广泛应用于医药、食品和环保等领域的绿色催化剂，具有反应条件温和、反应速度快和副产物少的特点。近年来，利用酶去除废水中的有机污染物成为污水处理
的一个热点。但是游离酶具有稳定性较差、对外界环境因素非常敏感、价格高和反应后并不能回收等缺陷，因此限制了酶在各个领域的应用。而将游离生物酶与固定化载体结合后，具有更宽的温度和酸碱耐受范围，酶的稳定性和可操作性加强。关于固定化漆酶处理废水中的有机污染物的研究比较广泛。固定化漆酶能够直接催化降解酚类化合物，但是因为漆酶的氧化还原电势比较低，催化降解非酚型化合物则需要一些低氧化还原势的化合物作为高效介体。然而，高效介体多为人工合成，价格昂贵且存在潜在的环境毒性。木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)是含亚铁血红素的过氧化物酶，具有较广泛的底物专一性，且仅在过氧化氢的存在下，就可催化降解苯酚、芳香胺、多环芳香化合物等多种有机污染物。相比于高效介体，过氧化氢的价格低廉，且不会产生毒性。因此，固定化木质素过氧化物酶处理废水中有机污染物具有极其广阔的工业研究与应用前景。目前，酶固定化载体的材料主要有壳聚糖、生物炭、硅胶和大孔树脂等，但是现有的固定化材料与酶结合不同程度的存在操作复杂，成本较高，重复回收利用率低，会产生二次污染等问题。如中国专利文献CN107117719A公开的《一种去除畜禽养殖废水中抗生素的方法》是将脂肪酶固定在生物炭上用于处理禽养殖废水中四环素类抗生素；CN103289982B公开的《一种新型固定化酶载体的制备》是以大孔吸附树脂为基础载体，利用戊二醛对其表面改性，得到一种新型固定化酶载体。以上固定化技术原材料易得，价格低廉，但是不方便回收重复使用。而CN106811458A公开的《一种固定化漆酶载体的制备方法和降解微量有机污染物的方法》是通过戊二醛交联被氨基修饰的二氧化硅固定化漆酶用于降解有机污染物；CN105110482B公开的《一种以固定化酶去除工业废水中扑热息痛的方法》是通过氨基化修饰、戊二醛活化的纳米碳球为载体，固定化辣根过氧化物酶去除工业废水中扑热息痛；CN107418950A公开的《多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用》是通过六臂聚乙二醇氨基磁性聚合物微球固定β葡萄糖苷酶，戊二醛交联反应修饰，固定化辣根过氧化物酶去除工业废水中苯酚。以上固定化技术具有操作简单和处理效率高优点，但是处理过程使用的戊二醛具有毒性，对生态环境和人体均具有危害。因此，亟需开发一种用于处理废水中有机物污染物的清洁、高效、低成本、可重复利用及操作简单的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺简便、安全无毒害的固定化木质素过氧化物酶的制备方法，同时提供该固定化木质素过氧化物酶处理废水中的有机污染物的应用本专利技术的固定化木质素过氧化物酶的制备方法，是以磁性纳米颗粒为载体，通过多巴胺聚合原位包埋制备磁性二氧化硅固定化木质素过氧化物酶，具体包括以下步骤：(1)制备四氧化三铁纳米粒子：按2-5g：0.5-2g：5-10g：100mL的比例，将三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸钠在持续搅拌下依次溶解在乙二醇中，然后转移至高压反应釜中，120-200℃下反应8-16h；冷却后，将固体沉淀用水和乙醇洗涤，最后真空干燥，即得到四氧化三铁纳米粒子；(2)制备磁性二氧化硅纳米粒子：按600mg：2-5mL的比例称取步骤(1)制备的四氧化三铁纳米粒子和正硅酸乙酯，将四氧化三铁纳米粒子均匀分散在水、乙醇和氨水的混合体系中，然后再逐滴滴加正硅酸乙酯，在15-35℃下振荡6-12h，用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即得到磁性二氧化硅纳米粒子；(3)制备多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子：按600mg：200-500mL的比例将步骤(2)中制备的磁性二氧化硅纳米粒子均匀分散在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，再以1.2-2.0mg/mL的浓度添加盐酸多巴胺，在15-35℃下振荡12-24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即获得多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子，作为固定化木质素过氧化物酶载体；(4)制备固定化木质素过氧化物酶：按1g：5-50mL的比例将步骤(3)中获得的固定化木质素过氧化物酶载体(多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子)均匀分散在含有木质素过氧化物酶的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，木质素过氧化物酶蛋白浓度为0.39mg/mL，在15-35℃下振荡6-24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用酒石酸-酒石酸钠缓冲液洗涤，直至上清液中无游离酶，最后冷冻干燥，即获得固定化木质素过氧化物酶。所述步骤(1)中制备的四氧化三铁纳米粒子的粒径为50-200nm。所述步骤(2)中水、乙醇和氨水的混合体系中水、乙醇和氨水的体积比例为15-20:70-80:1。所述步骤(4)中酒石酸-酒石酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为2.5-3.5。所述步骤(4)中固定化木质素过氧化物酶的粒径为200-400nm，酶固载量为3-6mg/g，酶活为100-200U/g。所述步骤(2)、(3)、(4)中的分散方法为机械搅拌或超声波方法。上述方法制备的固定化木质素过氧化物酶处理废水中的有机污染物，具体过程是：向含有机污染物的废水中加入固定化木质素过氧化物酶及过氧化氢，室温下反应1-24h，以去除有机污染物。实际操作中可定时取样，分析污染物的浓度变化，直至污染物去除率达到排放标准。所述固定化木质素过氧化物酶的加入量与废水中有机污染物的质量比为1g:1mg-10mg。所述过氧化氢在废水中的质量浓度为1.7-6.8mg/L。上述过程可用于通过固定化木质素过氧化物酶催化降解废水中多环芳烃、酚类、四环素类抗生素等有机污染物。本专利技术制备工艺简便，采用的固定化载体是纳米级颗粒，安全无毒害，稳定性好，制备的固定化木质素过氧化物酶具有36.5484m2/g的大比表面积，结合率为56.3-65.6％，在催化体系中的分散性较好，对污染物的去除效率更高，该固定化载体可以通过磁性分离回收重复利用固定化酶。附图说明图1是实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶的电镜图。图2是加酶量对固定化木质素过氧化物酶酶活及固定化酶的结合率的影响示意图。图3是盐酸多巴胺浓度对固定化木质素过氧化物酶酶活的影响示意图。图4是固定化时间对固定化木质素过氧化物酶酶活的影响示意图。图5是温度对游离木质素过氧化物酶和固定化木质素过氧化物酶相对活力的影响示意图。图6是pH对游离木质素过氧化物酶和固定化木质素过氧化物酶相对活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备四氧化三铁纳米粒子：按2‑5g：0.5‑2g：5‑10g：100mL的比例，将三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸钠在持续搅拌下依次溶解在乙二醇中，然后转移至高压反应釜中，120‑200℃下反应8‑16h；冷却后，将固体沉淀用水和乙醇洗涤，最后真空干燥，即得到四氧化三铁纳米粒子；(2)制备磁性二氧化硅纳米粒子：按600mg：2‑5mL的比例称取步骤(1)制备的四氧化三铁纳米粒子和正硅酸乙酯，将四氧化三铁纳米粒子均匀分散在水、乙醇和氨水的混合体系中，然后再逐滴滴加正硅酸乙酯，在15‑35℃下振荡6‑12h，用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即得到磁性二氧化硅纳米粒子；(3)制备多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子按600mg：200‑500mL的比例将步骤(2)中制备的磁性二氧化硅纳米粒子均匀分散在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，再以1.2‑2.0mg/mL的浓度添加盐酸多巴胺，在15‑35℃下振荡12‑24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即获得多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子，作为固定化木质素过氧化物酶载体；(4)制备固定化木质素过氧化物酶：按1g：5‑50mL的比例将步骤(3)中获得的固定化木质素过氧化物酶载体均匀分散在含有木质素过氧化物酶的酒石酸‑酒石酸钠缓冲液中，木质素过氧化物酶蛋白浓度为0.39mg/mL，在15‑35℃下振荡6‑24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用酒石酸‑酒石酸钠缓冲液洗涤，直至上清液中无游离酶，最后冷冻干燥，即获得固定化木质素过氧化物酶。...

【技术特征摘要】
1.一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备四氧化三铁纳米粒子：按2-5g：0.5-2g：5-10g：100mL的比例，将三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸钠在持续搅拌下依次溶解在乙二醇中，然后转移至高压反应釜中，120-200℃下反应8-16h；冷却后，将固体沉淀用水和乙醇洗涤，最后真空干燥，即得到四氧化三铁纳米粒子；(2)制备磁性二氧化硅纳米粒子：按600mg：2-5mL的比例称取步骤(1)制备的四氧化三铁纳米粒子和正硅酸乙酯，将四氧化三铁纳米粒子均匀分散在水、乙醇和氨水的混合体系中，然后再逐滴滴加正硅酸乙酯，在15-35℃下振荡6-12h，用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即得到磁性二氧化硅纳米粒子；(3)制备多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子按600mg：200-500mL的比例将步骤(2)中制备的磁性二氧化硅纳米粒子均匀分散在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，再以1.2-2.0mg/mL的浓度添加盐酸多巴胺，在15-35℃下振荡12-24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即获得多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子，作为固定化木质素过氧化物酶载体；(4)制备固定化木质素过氧化物酶：按1g：5-50mL的比例将步骤(3)中获得的固定化木质素过氧化物酶载体均匀分散在含有木质素过氧化物酶的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，木质素过氧化物酶蛋白浓度为0.39mg/mL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴超，郭瑾，葛蔚，张小梅，柳修楚，陈小宇，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37