蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44制造技术

本发明专利技术公开了蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，以及扩增它的专用引物和检测该基因在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法及其特异引物。该基因在蔗茅野生种受低温胁迫下表达量持久上升，在甘蔗栽培品种(系)均无明显表达，表明该基因直接参与了低温胁迫响应。本发明专利技术为认识该基因的抗逆机制，以及利用蔗茅野生种作为甘蔗耐寒新品种开发的重要资源提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及低温胁迫下蔗茅野生种的基因EfNAC44，以及该基因的专用引物，通过RT-qPCR对该基因在强弱蔗茅野生种、栽培种差异表达的方法。
技术介绍
蔗茅(ErianthusfulvusNess.)源于热带、亚热带和温带区域，是甘蔗属内的野生种之一，在中国境内分布极广，拥有较强的抗旱、抗寒和耐瘠能力。蔗茅在气候寒冷的高海拔地区也能正常生长，在其他恶劣的环境下也可发现有蔗茅的生长。蔗茅还拥有其余甘蔗近缘野生种所不具备的特性，成熟早，种子成熟率高，优良的花粉发育，体细胞染色体数目最少，不单单适合常规育种，也在分子育种方面占有优势，蔗茅茎秆中糖分含量也较高，在甘蔗育种中具有重大的价值。蔗茅中富含丰富的抗逆基因，能为甘蔗品种改良和耐逆境育种提供优良的基因源。(徐超华，李纯佳，陆鑫等.甘蔗近缘种蔗茅光合气体交换特性的差异分析[J].中国农业科学，2016,49(15):2909-2920.李富生，林位夫，何顺长.开发利用蔗茅野生种质资源的思考[J].生物资源,2004,20(4):266-270.田春艳，王先宏，李富生等.甘蔗野生种蔗茅的形态多样性分析[J].中国农学通报，2015,31(15):97-102.陆鑫，苏火生，林秀琴等.甘蔗野生种滇蔗茅种质创新利用研究[J].湖南农业大学学报，2012,38(2):121-124.)因此，在甘蔗耐寒育种中，挖掘蔗茅野生种中新的耐寒基因具有重要意义。NAC转录因子是近年来发现的新转录因子，成员众多，组建了巨大的转录因子家族。NAC有着典型和非典型之分，典型是N端含有151-159个氨基酸残基并且高度保守，C端转录调控区的模体在亚组内保守性较高，非典型NAC转录因子仅仅是一个或者两个串联的结构域。研究表明NAC基因除了在抗旱、耐盐胁迫反应起作用外，在低温胁迫反应中同样可以起到调控作用：NAC基因通过调节耐寒相关基因的表达，通过调控耐寒相关基因的表达量来进一步调控植物耐寒性。(韩雅彭，程琳，杨凌霄等.茶树NAC转录因子家族的鉴定及生物信息学分析[J].河南大学学报，2017,47(3):301-309.周鸿慧，黄红，徐彬磊等.NAC转录因子在植物对生物和非生物胁迫响应中的功能[J].植物生理学报2017,53(8):1372-1382.段俊枝，李莹，赵明忠等.NAC转录因子在植物非生物胁迫基因工程中的应用进展[J].作物杂志，2017,(2):14-22.)前人对于甘蔗研究较为深入，但主要局限于生理生化上的研究，对于甘蔗基因组的研究较少，NCBI数据库中甘蔗的遗传信息数据也十分有限，尤其关于蔗茅野生种耐寒有关的NAC基因更是未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是从分子育种角度为解决近年来甘蔗受冻害等严重技术问题，提高甘蔗栽培种的耐寒性提供一个受低温诱导后能够快速表达的蔗茅类基因EfNAC44，并且提供该基因的扩增引物，以及检测该基因在蔗茅野生种的差异表达的方法，进一步为甘蔗耐寒育种奠定基础并提供候选基因。本研究从低温胁迫条件下的蔗茅野生种利用电子克隆技术获得一个NAC基因，通过NCBI数据库比对分析，发现该基因序列与已知基因序列相似比达96％，推测该基因编码蛋白为NAC转录因子，故将该基因命名为蔗茅类基因EfNAC44。本专利技术的技术方案如下：1.蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，其全长核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.扩增技术方案1所述的蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44的专用引物，所述专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测技术方案1所述的蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法，包括低温胁迫处理，总RNA的提取，cDNA第一链的合成，相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况，其特征在于：在相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况中，使用特异引物分别检测蔗茅类基因EfNAC44在对照样品和处理样品中差异表达，所述特异引物由上游引物QF和下游引物QR组成，所述上游引物QF的碱基序列如SEQIDNO:4所示，所述下游引物QR的碱基序列如SEQIDNO:5所示。4.根据技术方案3所述的差异表达方法，其特征在于，在所述的相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况中，RT-qPCR反应体系：总体积25μl，其中，2×SuperRealPreMixPlus10μl，10μM上游引物QF0.6μl，10μM下游引物QR0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROXReferenceDye0.6μl，RNase-freeddH2O12.2μl；RT-qPCR反应程序：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术首次提出了蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，以及扩增它的专用引物、检测该基因在不同材料中受低温胁迫下的差异表达的特异引物、检测方法。在RT-qPCR检测中该基因在没有低温胁迫的情况下在蔗茅中均少量表达，在甘蔗栽培品种(系)几乎不表达，低温处理后在蔗茅野生种中的表达量大幅度上升，说明该基因在蔗茅野生种受到低温胁迫后表达量上升，且耐寒性强的蔗茅野生种表达量处理前后均高于耐寒性较弱的蔗茅野生种，而甘蔗栽培品种(系)中处理前后均无明显表达，表明所述蔗茅类基因EfNAC44属于受低温胁迫表达的诱导型表达基因，该蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受到低温胁迫后能迅速的参与低温胁迫响应过程，通过表达量的上调从而调控蔗茅野生种的耐寒机制，为认识蔗茅类NAC基因的抗逆机制，利用蔗茅野生种进行分子育种提供了技术支撑。本专利技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受低温胁迫的差异表达的方法，所设计的特异引物在RT-qPCR特异性强，无杂带产生，熔解曲线显示无引物二聚体产生。在内参基因的选择上，5种候选内参基因，分别为25SrRNA，GAPDH，β-actin，β-tubulin，PPO，本试验选择最合适甘蔗的内参25SrRNA，其稳定性更高。本RT-qPCR采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行，具有特异性强，灵敏度高，重复性好等特点。序列表中SEQIDNO:1所示的是蔗茅类基因EfNAC44的全长核苷酸序列。序列表中SEQIDNO:2所示的扩增蔗茅类基因EfNAC44的专用引物的上游引物GP-F的碱基序列。序列表中SEQIDNO:3所示的扩增蔗茅类基因EfNAC44的专用引物的下游引物GP-R的碱基序列。序列表中SEQIDNO:4所示的是特异引物的上游引物QF的碱基序列。序列表中SEQIDNO:5所示的是特异引物的下游引物QR的碱基序列。序列表中SEQIDNO:6所示的是内参基因25SrRNA的上游引物25S-F的碱基序列。序列表中SEQIDNO:7所示的是内参基因25SrRNA的下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，其全长核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.扩增权利要求1所述的蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44的专用引物，所述专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQIDNO：3所示。3.一种检测权利要求1所述的蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法，包括低温胁迫处理，总RNA的提取，cDNA第一链的合成，相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况，其特征在于：在相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况中，使用特异引物分别检测蔗茅...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富生，曹哲群，孟玉，陈疏影，何丽莲，徐荣，王先宏，刘鲁峰，狄义宁，肖芙荣，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53