一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用制造技术

一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78‑C基因cDNA，从棉铃虫中克隆得到蜕皮激素诱导因子E78‑C基因，并对棉铃虫的蜕皮激素诱导因子E78‑C基因设计引物，选取SEQ ID NO.1中第658‑1122位作为E78‑C靶标基因片段合成dsRNA，再将合成的dsRNA通过显微注射方式传递到棉铃虫的体腔，以绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，统计注射dsRNA后的棉铃虫产卵量表明以棉铃虫E78‑C基因作为干涉靶标基因，对棉铃虫进行注射干扰，沉默基因的转录表达，从而抑制棉铃虫卵巢发育，降低产卵量，进而控制其种群数量；且害虫产生抗性的风险低，为创制新型生物杀虫剂及植物抗虫基因工程提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用
本专利技术涉及昆虫生长生殖调控与生物
，尤其涉及一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用。
技术介绍
棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)是一种世界性分布、多食性的重要农业害虫，严重危害棉花、玉米、小麦、番茄等多种作物，从而造成巨大的经济损失。转基因Bt(Bacillusthuringiensist)棉的广泛应用有效的控制了棉铃虫的危害，但是棉铃虫对转Bt棉花的抗性问题也在显著地增加，与此同时棉铃虫对其它非转基因作物的危害也在逐年加剧。因此，随着社会的不断发展，迫切需要有新的害虫防治方法结合或替代Bt作物以实现现代农业的可持续发展。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是几年来发现的一种重要基因沉默手段，该技术通过双链RNA(dsRNA,Double-strandedRNA,双链核糖核酸)高效特异性降解对应序列的mRNA，由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，故该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。目前该技术在植保领域已成为新的害虫防治手段，该技术利用昆虫自身基因片段，通过RNAi抑制昆虫体内生长发育或生化代谢中关键基因的表达，进而控制害虫危害。在2007年，已有文献公开利用转基因技术表达靶标害虫致死基因的dsRNA以控制害虫(Baumetal.，2007.ControlofcoleopteraninsectpeststhroughRNAinterference.Nat.Biotechnol.25,1322-1326；Maoetal.,2007.SilencingacottonbollwormP450monooxygenasegenebyplant-mediatedRNAiimpairslarvaltoleranceofgossypol.NatBiotechnol.25(11):1307-1313.)，2017年有科学家发现将干扰保幼激素结合蛋白juvenilehormonebindingprotein(JHBP)与Bt毒素结合可以更好地防治棉铃虫(Nietal.,2017.Next-generationtransgeniccotton:pyramidingRNAiandBtcountersinsectresistance.PlantBiotechnolJ.15(9):1204-1213.)。RNAi技术凭借其抗虫专一性、对非靶标生物无杀伤作用和对环境无毒无害的优势，在农业植保防治领域具有广阔的发展前景。而实现基于RNAi害虫有效控制的关键问题是筛选害虫特异性及对其生长发育有明显抑制作用的靶标基因。昆虫的生长发育、蜕皮、变态、滞育、生殖、多型现象等生理过程以及行为反应等均离不开激素的参与，昆虫激素已成为杀虫剂研究与开发的一个重点领域，不同于传统作用于神经系统的杀虫剂，其作用毒性低、污染少、对天敌和有益生物影响小，有助于可持续农业的发展、有利于无公害绿色食品生产、有益于人类健康。昆虫的保幼激素与蜕皮激素是昆虫体内的重要激素，在昆虫的变态、发育、生殖及滞育、群集、交配等多种行为中发挥着重要的调控作用。E78是一种蜕皮激素诱导基因，它是蜕皮激素诱导转录早期基因，对昆虫的生殖和胚胎发育具有重要作用(Russelletal.,1996.TheDrosophilaEip78Cgeneisnotvitalbuthasaroleinregulatingchromosomepuffs.Genetics,144,159-170.)。在农业害虫防治方面，科学家发现并构建了可以表达激素相关靶标基因的dsRNA棉花，通过转基因棉花与非转基因棉花对比，棉铃虫取食后可以显著的抑制棉铃虫的生长与生殖能力(Xiongetal.,2013.SilencingtheHaHR3genebytransgenicplant-mediatedRNAitodisruptHelicoverpaarmigeradevelopment.IntJBiolSci,9(4):370-381；Tianetal.,2015.Transgeniccottonplantsexpressingdouble-strandedRNAstargetHMG-CoAreductase(HMGR)geneinhibitsthegrowth,developmentandsurvivalofcottonbollworms.IntJBiolSci,11(11):1296-1305)。这个研究表明通过RNAi技术防治农业害虫的可行性，展现出良好的前景可见。由于昆虫的保幼激素和蜕皮激素是昆虫特有的，故针对激素作用途径作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发新型的杀虫剂，应用于害虫的防治具有很大的潜力。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用，以解决上述
技术介绍
中的缺点。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA，包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列、如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列及如SEQIDNO.3所示的靶标基因序列，具体序列如下：SEQIDNO.1SEQIDNO.2SEQIDNO.3taatacgactcactataggggacgactctgaaggcagtggcggcgaggacgtggcgtcgtcgagcactgacgccgtgaccgacatgcggtctatgctgtggcacagattcgcgcagcaaatgactcccgccatccctctagtggtcgagttcgccaagcgactgcccggcttcttcagcctcccgcaagatgaccatcttatcctcattaagcaagggttcttcgaagtctggctgactcgtgtgaccgaccactctactcaggagtgcatcatgttcgagaatggcactacatttacctatcaggagctgatggtgatgtatgatcaaccatttgcgacggcactgatgacgtacatttggaaaattctgaggatgcagatcaccgaggaagagatggccttgtacaccagcaccctgctgatgtgcccgcaccgcgtcggcctcagcacccccgaccgcatcagtggtctgcagcaaaccttgaacgacgcaccctatagtgagtcgtatta。棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因的cDNA克隆方法，具体步骤如下：(1)提取棉铃虫雌虫总RNA，而后反转录合成cDNA，并对cDNA进行比对分析以确定棉铃虫E78-C基因的cDNA序列；(2)根据步骤(1)获得的棉铃虫E78-C基因的cDNA序列，设计E78-C基因的特异性引物，特异性正向引物序列如SEQIDNO.4所示，特异性反向引物序列如SEQIDNO.5所示：SEQIDNO.4：TAATACGACTCACTATAGGGGACGACTCTGAAGGCAGTGSEQIDNO.5：TAATACGACTCACTATAGGGTGCGTCGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78‑C基因cDNA，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列及如SEQ ID NO.3所示的靶标基因序列，具体序列如下：SEQ ID NO.1

【技术特征摘要】
1.一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA，其特征在于，包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列、如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列及如SEQIDNO.3所示的靶标基因序列，具体序列如下：SEQIDNO.1SEQIDNO.2SEQIDNO.3taatacgactcactataggggacgactctgaaggcagtggcggcgaggacgtggcgtcgtcgagcactgacgccgtgaccgacatgcggtctatgctgtggcacagattcgcgcagcaaatgactcccgccatccctctagtggtcgagttcgccaagcgactgcccggcttcttcagcctcccgcaagatgaccatcttatcctcattaagcaagggttcttcgaagtctggctgactcgtgtgaccgaccactctactcaggagtgcatcatgttcgagaatggcactacatttacctatcaggagctgatggtgatgtatgatcaaccatttgcgacggcactgatgacgtacatttggaaaattctgaggatgcagatcaccgaggaagagatggccttgtacaccagcaccctgctgatgtgcccgcaccgcgtcggcctcagcacccccgaccgcatcagtggtctgcagcaaaccttgaacgacgcaccctatagtgagtcgtatta。2.如权利要求1所述的一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因的cDNA克隆方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提取棉铃虫雌虫总RNA，而后反转录合成cDNA，并对cDNA进行比对分析以确定棉铃虫E78-C基因的cDNA序列；(2)根据步骤(1)获得的棉铃虫E78-C基因的cDNA序列，设计E78-C基因的特异性引物，特异性正向引物序列如SEQIDNO.4所示，特异性反向引物序列如SEQIDNO.5所示：SEQIDNO.4：TAATACGACTCACTATAGGGGACGACTCTGAAGGCAGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张万娜，肖海军，吴珍平，黄孝龙，江婷，许洋，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36