本发明专利技术涉及一组糖基转移酶及其应用。具体地，提供了糖基转移酶GT29‑32、GT29‑33、GT29‑34、GT29‑4、GT29‑5、GT29‑7、GT29‑9、GT29‑11、GT29‑13、GT29‑17、GT29‑18、GT29‑24或GT29‑25及其衍生多肽在四环三萜类化合物底物C‑20位第一个糖基和C‑6位第一个糖基上进行催化从而延伸糖链，以便获得人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、绞股蓝皂苷LXXV、绞股蓝皂苷XVII、三七皂苷U和、三七皂苷R1和三七皂苷R2等人参皂苷产物的催化反应。本发明专利技术糖基转移酶还可应用于构建人工合成人参皂苷及多种新人参皂苷及其衍生物。
【技术实现步骤摘要】
一组催化糖链延伸的UDP-糖基转移酶及其应用
本专利技术涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本专利技术涉及一组糖基转移酶及其应用。
技术介绍
人参皂苷是从人参属植物(如人参、三七和西洋参等)和绞股蓝中分离到的皂苷的总称，是一类三萜化合物。人参皂苷亦可以根据其分离的来源称为人参皂苷，三七皂苷和绞股蓝皂苷。人参皂苷是这些药用植物中的主要生物活性成份。目前，已经分离出了约150种皂苷。从结构上来看，人参皂苷主要是皂苷元经过糖基化后形成的生物活性小分子。人参皂苷的皂苷元只有有限的几种，主要是达玛烷型四环三萜的原人参二醇和原人参三醇，以及齐墩果烷酸。皂苷元通过糖基化后，可以提高水溶性，改变其亚细胞定位，并产生出不同的生物活性。绝大部分原人参二醇型皂苷是在C3和/或C20位羟基进行糖基化修饰，而原人参三醇型皂苷是在C6和/或C20的羟基上进行糖基化修饰。不同类型的糖基以及不同程度的糖基化修饰产生了分子结构繁多的人参皂苷。具有不同糖基化修饰方式的人参皂苷具有不同的生物活性。例如Rb1，Rb2和Rb3分别是在Rd的C20-O-Glc延伸一分子葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。实验证实丰富皂苷Rb1具有保护神经细胞和抗炎症抗氧化的功效；Rb2具有抑制肿瘤血管生成与肿瘤转移、降低糖尿病小鼠血糖以及降低血脂的功效；Rb3具有减缓心肌缺血和抗抑郁的功效。人参皂苷以人参或者三七的总皂苷或者丰富皂苷为原料，依赖化学、酶和微生物发酵的水解方法进行制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参皂苷资源目前来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，所以，人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度的天然与非天然的人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。近年来通过对人参、三七和西洋参的转录组和功能基因组研究，人参皂苷皂苷元合成途径的解析已经有了非常大的进展。2006年，日本和韩国科学家分别鉴定了将环氧角鲨烯转化为达玛烯二醇的萜环化酶元件达(玛烯二醇合成酶，PgDDS)。2011年到2012年，韩国科学家又鉴定了把达玛烯二醇氧化为原人参二醇以及把原人参二醇进一步氧化为原人参三醇的细胞色素P450元件CYP716A4和CYP716A53v2。利用合成生物学方法来人工合成这些具有药用活性的人参皂苷，不仅需要构建合成皂苷元的代谢途径，还需要鉴定催化人参皂苷的糖基化的UDP-糖基转移酶。UDP-糖基转移酶的功能是将糖基供体(核苷二磷酸糖，例如UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖)上的糖基转移到不同的糖基受体上。从目前已测序的植物基因组分析，植物基因组往往编码了上百种以上不同的糖基转移酶。由于UDP-糖基转移酶可能催化的底物(包括糖基供体和糖基受体)非常多样，这个UDP-糖基转移酶的功能鉴定带来了很大的困难。直到2014年，第一个参与人参皂苷糖基化的UDP-糖基转移酶(UGTPg1)才被中国学者鉴定出来，它可以在原人参二醇型人参皂苷的C20羟基转入一个葡萄糖基。随后，随后，韩国科学家又在人参中克隆两个UDP-糖基转移酶元件(PgUGT74AE2和PgUGT94Q2)，它们可以在原人参二醇型皂苷的C3位上分别转入一个葡萄糖基和进行一个葡萄糖基的延伸。几乎与此同时，中国学者也独立地从人参中克隆了两个与PgUGT74AE2和PgUGT94Q2具有相同功能的糖基转移酶元件UGTPg45和UGTPg29。2015年中国学者又进一步鉴定了能在原人参三醇C6位转入一个葡萄糖基的UDP-糖基转移酶元件(UGTPg100)。2015年韩国学者在绞股蓝中发现了一个能在原人参二醇型和原人参三醇型皂苷的C20延伸一个葡萄糖基的糖基转移酶GpUGT23。但是到目前为止，除了在C3位延伸一个葡糖糖基的糖基转移酶植物，人参中能催化糖链延伸的其它糖基转移酶还未有报道。在这种背景下，本专利技术人对人参中能在原人参二醇型和原人参三醇型皂苷的C20延伸一个葡萄糖基或者木糖糖基的糖基转移酶以及能在原人参三醇型皂苷的C6延伸一个木糖糖基的糖基转移酶进行了克隆和鉴定。该糖基转移酶可用于包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、绞股蓝皂苷LXXV、绞股蓝皂苷XVII、三七皂苷U、三七皂苷R1、三七皂苷R2和三七皂苷R3等人参皂苷的制备。
技术实现思路
本专利技术提供了一组新的糖基转移酶以及制备利用其催化四环三萜类化合物糖基化反应的方法。本专利技术第一方面，提供了一种体外糖基化方法，包括步骤：在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：C20位的第一个糖基上；从而形成糖基化的四环三萜类化合物；其中，所述的糖基转移酶选自：如SEQIDNO.:4、6和8所示的糖基转移酶或其衍生多肽。本专利技术第二方面，提供了一种体外糖基化方法，包括步骤：在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：C6位的第一个糖基上；从而形成糖基化的四环三萜类化合物；其中，所述的糖基转移酶选自：如SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、24、26、28和30所示的糖基转移酶或其衍生多肽。在另一优选例中，所述衍生多肽分别选自下组：(a)具有SEQIDNOs.:4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQIDNOs：4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28或30添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；(c)氨基酸序列与SEQIDNOs：4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条中所示氨基酸序列的同源性≥95％，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。在另一优选例中，(c)中还包括将SEQIDNOs.:4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。本专利技术第三方面，提供了一种分离的多肽，所述的分离的多肽为：SEQIDNOs.:4、6、8、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽或其衍生多肽；其中，所述衍生多肽选自：(a)具有SEQIDNOs.:4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽；(b)将本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体外糖基化方法，其特征在于，包括步骤：在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：C20位的第一个糖基上；从而形成糖基化的四环三萜类化合物；其中，所述的糖基转移酶选自：如SEQ ID NO.:4、6和8所示的糖基转移酶或其衍生多肽。
【技术特征摘要】
1.一种体外糖基化方法，其特征在于，包括步骤：在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：C20位的第一个糖基上；从而形成糖基化的四环三萜类化合物；其中，所述的糖基转移酶选自：如SEQIDNO.:4、6和8所示的糖基转移酶或其衍生多肽。2.一种体外糖基化方法，其特征在于，包括步骤：在糖基转移酶存在下，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的以下位点上：C6位的第一个糖基上；从而形成糖基化的四环三萜类化合物；其中，所述的糖基转移酶选自：如SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、24、26、28和30所示的糖基转移酶或其衍生多肽。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述衍生多肽分别选自下组：(a)具有SEQIDNOs.:4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQIDNOs：4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28或30添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的、并具有糖基转移酶活性的衍生多肽；(c)氨基酸序列与SEQIDNOs：4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条中所示氨基酸序列的同源性≥95％，并具有糖基转移酶活性的衍生多肽。4.一种分离的多肽，其特征在于，所述的分离的多肽为：SEQIDNOs.:4、6、8、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽或其衍生多肽；其中，所述衍生多肽选自：(a)具有SEQIDNOs.:4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中任一条所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，魏维，严兴，杨成帅，魏勇军，王平平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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