一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术属于细胞治疗领域，具体涉及一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，具体包括如下步骤：获取小鼠躯干皮肤；提取树突状T淋巴细胞；扩增树突状T淋巴细胞。采用本发明专利技术的技术方法可以获得高纯度的树突状T淋巴细胞，将细胞培养4周，纯度可达98％以上，远远大于原代培养技术，为后期康复性困难病人的治疗奠定了坚实基础。

【技术实现步骤摘要】
一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法
本专利技术属于细胞治疗领域，具体涉及一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendriticcells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟树突状细胞具有较强的迁移能力，成熟树突状细胞能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节，树突状细胞是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原呈细胞，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子，免疫共刺激分子。树突状细胞是一种异质性细胞群，由于树突状细胞的特异性，它在激活免疫应答和诱导免疫耐受中都具有很重要的作用。树突状细胞广泛存在于肝、脾、血液、淋巴及皮肤等组织器官，是生物体内免疫系统中的抗原呈递细胞，参与对抗原的捕捉、加工、处理以及呈递等环节，是机体产生免疫应答的重要功能细胞之一，其可激活针对各种病原体的特异性T淋巴细胞反应，从而增强诱导产生T细胞介导的细胞毒作用，提高机体的细胞免疫水平，特别是可显著提高自身抗原或其他弱抗原诱导的特异性反应，在抗感染、抗肿瘤、自身免疫疾病及移植排斥中发挥重要作用。人树突状细胞起源于造血干细胞(hemopoieticstemcell)。树突状细胞的来源有两条途径：髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化为树突状细胞，称为髓样树突状细胞(myeloiddendriticcells，MDC)，也称DCl，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞；包括朗格汉斯细胞(Langerhanscells，LCs)，间皮(或真皮)树突状细胞以及单核细胞衍生的树突状细胞等来源于淋巴样干细胞，称为淋巴样树突状细胞(Lymophioddendriticcells，LDC)或浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendriticcells，piX)，即DC2，与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞。树突状细胞尽管数量不足外周血单核细胞的1％，但表面具有丰富的抗原递呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能强大的专职抗原递呈细胞(APC)。树突状细胞自身具有免疫刺激能力，是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞的专职抗原递呈细胞。表皮组织是皮肤的最外层，构成了机体抵御外界病原入侵的第1道屏障，并且是机体发生快速免疫应答的重要防线。而树突状表皮内T淋巴细胞(DETCs)是构成表皮组织免疫微环境的重要组成部分。T细胞按照T细胞受体(TCR)的不同可分为αβT细胞和γδT细胞。而DETCs主要表达γδTCR，故也被称为表皮内γδT细胞。研究表明小鼠DETCs的γδTCR主要是Vγ3/Jγc1-Cγ1链和Vδ1/Dδ2/Jδ2-Cδ链构成。随着γδT细胞在肿瘤、创面愈合中的作用被广泛认同，它们在其它免疫过程中的重要作用也被越来越多的研究者关注，因此在体外对DETCs进行扩增培养在进行相关研究就变得尤为重要。目前的DETCs体外培养面临诸多困难，首先，DETCs提取困难，皮肤上皮组织由大量的角质形成细胞，γδT细胞，骨髓来源细胞，黑色素细胞等组成，DETCs在正常表皮中的比例只占5﹪～9％，而DETCs体外研究以及用于临床治疗对其纯度要求很高，其次，应用目前的培养技术来做体外培养的DETCs很难长期存活。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，使用本技术方法分离培养的高纯度的树突状表皮内T淋巴细胞纯度更高并且可以在体外进行长期培养，从而满足对于树突状表皮内T淋巴细胞质量与数量的要求。为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，包括如下步骤：A.获取小鼠躯干皮肤；B.提取树突状T淋巴细胞；C.扩增树突状T淋巴细胞。优选地，所述获取小鼠躯干皮肤的方法为：将8～12周龄的小鼠麻醉后剃去毛发，将脱毛膏均匀涂抹鼠背，3～8min后擦拭，去除脱毛膏和毛发，放回鼠笼；8～14小时后再次麻醉小鼠，断颈处死，用酒精溶液浸泡；无菌取下小鼠皮肤。优选地，所述体积分数为70～85％，浸泡时间为2～8分钟。优选地，所述提取树突状T淋巴细胞的方法为：B1、将小鼠皮肤置于磷酸缓冲液中浸泡并去掉皮下筋膜、脂肪和真皮，将其浸泡在中性蛋白酶Ⅱ中分离真皮得到表皮；B2、将剪碎后的表皮置于胰酶溶液中，摇匀，孵育；然后加入培养基，使用滴管反复吹打细胞液，360～440目无菌细胞筛过滤，即得小鼠表皮细胞悬液，收集滤液，离心；B3、弃掉上清液，加入重悬细胞，分离出单核细胞，并将其置于培养基中，离心，弃掉上清液，即得。进一步地，对所述步骤B1中小鼠皮下筋膜、脂肪和真皮，浸泡于中性蛋白酶Ⅱ之前对其进行剪块处理，其标准是将皮肤剪成约为1cm2小块；更进一步地，所述磷酸缓冲液的体积为18～25mL，所述中性蛋白酶Ⅱ的浓度为0.3～0.8g/100mL，所述浸泡条件是在3～6℃条件下密封浸泡12～16小时。进一步地，所述步骤B2中胰酶溶液的体积为2mL，浓度为0.15～0.45g/100mL，所述孵育为在32～38℃的条件下孵育12～18min，所述培养基为DMEM培养基，其中含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，所述收集滤液后在300g离心力的作用下离心6～14min。进一步地，所述步骤B3中重悬细胞的体积为3～8mL，所述组成为在DMEM培养基中含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素混合液组成的重悬细胞，其目的是终止细胞消化，滴管反复吹打细胞液的次数要不少于100次，确保其终止完全；所述离心的条件为在300g离心6～14min。优选地，所述扩增树突状T淋巴细胞的方法为：向由RPMI1640培养基、体积分数为10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、50uMβ-巯基乙醇组成的混合液中加入刀豆蛋白A和吲哚美辛，重悬细胞，调整细胞浓度到4×105/mL，接种细胞并进行培养。优选地，所述刀豆蛋白的最终浓度为2ug/mL，吲哚美辛最终浓度为4ug/mL，所述接种的原则是接入48孔板中，每孔接种500uL，在35～40℃，体积分数为4～6％CO2条件下进行培养。其工作原理，DETCs交错分布于表皮组织中，表达Vγ3Vδ1TCR，是表皮中最主要的T淋巴细胞。小剂量刀豆蛋白A(ConA)刺激T细胞分裂增殖，利用吲哚美辛的抗炎作用对抗细胞自身的炎性反应，利用活T细胞沉降在培养皿底部的特性，吸取上层培养液，进行细胞换液，重复此动作4周后达到目标纯度。进一步地，在培养过程中，更换的原则是细胞液每隔四天半更换一次；即在吸弃200uL培养液，再加入200uL新鲜由RPMI1640培养基、体积分数为10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、50uMβ-巯基乙醇组成的混合液；7天后往细胞培养孔中添加刀豆蛋白A使其最终本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：A.获取小鼠躯干皮肤；B.提取树突状T淋巴细胞；C.扩增树突状T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：A.获取小鼠躯干皮肤；B.提取树突状T淋巴细胞；C.扩增树突状T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述获取小鼠躯干皮肤的方法为：将8～12周龄的小鼠麻醉后剃去毛发，将脱毛膏均匀涂抹鼠背，3～8min后擦拭，去除脱毛膏和毛发，放回鼠笼；8～14小时后再次麻醉小鼠，断颈处死，用酒精溶液浸泡；无菌取下小鼠皮肤。3.根据权利要求1所述的树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述酒精溶液的体积分数为70～85％，浸泡时间为2～8分钟。4.根据权利要求1所述的树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述提取树突状T淋巴细胞的方法为：B1、将小鼠皮肤置于磷酸缓冲液中浸泡并去掉皮下筋膜、脂肪和真皮，将其浸泡在中性蛋白酶Ⅱ中分离真皮得到表皮；B2、将剪碎后的表皮置于胰酶溶液中，摇匀，孵育；然后加入培养基，使用滴管反复吹打细胞液，360～440目无菌细胞筛过滤，即得小鼠表皮细胞悬液，收集滤液，离心；B3、弃掉上清液，加入重悬细胞，分离出单核细胞，并将其置于培养基中，离心，弃掉上清液，即得。5.根据权利要求4所述的树突状表皮T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤B1中磷酸缓冲液的体积为18～25mL，所述中性蛋白酶Ⅱ的浓度为0.3～0.8g/100mL，所述浸泡条件是在3～6℃条件下密封浸泡12～16小时。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘美希，罗高兴，贺伟峰，燕荣帅，杨加彩，胡晓红，龚雅利，罗小强，张成，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50