一种新型饵料微藻及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种新型饵料微藻及其制备和应用。新型饵料微藻为于2018年7月17号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的两株微藻，两株微藻的分类名称均为亚心型四爿藻，也称亚心型扁藻，保藏编号分别为CGMCC No.16115和CGMCC No.16116。本发明专利技术新型饵料微藻亚心型四爿藻藻株能够杀灭水产养殖中普遍存在的病害微生物，从而预防和减少水产养殖病害的发生，可应用于水产养殖饵料微藻。

【技术实现步骤摘要】
一种新型饵料微藻及其制备和应用
本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种新型饵料微藻及其制备和应用。
技术介绍
党的“十八大”将“实施海洋开发、建设海洋强国”作为提高我国综合国力、推动经济发展的国家发展战略。国务院明确提出将海洋渔业发展纳入建设海洋强国战略。水产养殖是海洋渔业的重要组成部分，提升现代渔业规模化、标准化、产业化水平，建设“海上粮仓”，促进现代渔业持续健康发展势在必行。近年来水产养殖饱受病害的困扰，而防治措施以施用抗生素及化学药物为主。这样的防治措施不仅会在水产动物体内长期残留，破坏水产动物肠道正常的菌群平衡，长期使用致病菌会产生耐药性，也会影响生态平衡，污染环境。寻找和研发新型的病害防治措施对水产养殖业的可持续发展和转型升级尤为重要。抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。因其广谱抗菌性及环境友好型等特点，是非常有发展潜力的抗生素的替代品。但鉴于水产动物生长的特殊性，抗菌肽制剂难以直接用于水产动物幼苗的培育，怎样突破这一环节成为抗菌肽应用的难点。目前国内外抗菌肽的专利技术专利非常多，多集中于抗菌肽活性及抗菌肽生产制备，但将其应用于水产养殖业尚未有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的携带抗菌肽的饵料微藻及其制备和在水产养殖中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种新型饵料微藻，新型饵料微藻为于2018年7月17号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的两株微藻，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，两株微藻的分类名称均为亚心型四爿藻，也称亚心型扁藻，拉丁名是Tetraselmissubcordiformis,也可称为Platymonassubcordiformis；保藏编号分别为CGMCCNo.16115和CGMCCNo.16116。所述两株饵料微藻藻株，即两株亚心型四爿藻基因改良藻株（Tetraselmissubcordiformis），具有典型的绿藻门，青绿藻纲特征性结构，具有4个鞭毛，一个巨大的杯型叶绿体，特征与亚心型四爿藻一致。在无菌f/2培养液中能快速生长，温度20-25oC，光照5000-8000LUX，营养细胞侧面观呈椭圆形，颜色呈绿色。所述的两株新型饵料微藻生理生化特征如下：在无菌的海水培养液f/2中能够快速生长，培养温度为20-23oC，光照强度5000-8000LUX，光暗比为12h/12h。初始接种量为OD730=0.10，3天后进入对数生长期，10天后进入稳定期，OD730=0.40，细胞浓度可达1×106细胞/ml。细胞以分裂生殖为主，最适pH范围：7.5-8.5。进一步的说，将SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽分别插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的所述保藏编号分别为CGMCCNo.16115和CGMCCNo.16116亚心型四爿藻突变株。进一步的说，将SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽依次插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的亚心型四爿藻突变株。一种新型饵料微藻的构建方法，将SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽分别插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的所述保藏编号分别为CGMCCNo.16115和CGMCCNo.16116亚心型四爿藻突变株。将SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽依次插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的亚心型四爿藻突变株。一种新型饵料微藻的应用，所述微藻作为水产养殖产业的饵料或水产病害菌抑制剂的应用。所述微藻在制备抑制副溶血弧菌、创伤弧菌或嗜水气单胞菌中抑制剂的应用。一种新型水产养殖产业饵料，饵料为含有SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽的保藏编号分别为CGMCCNo.16115或CGMCCNo.16116亚心型四爿藻突变株。所述饵料还可为含有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽的亚心型四爿藻突变株。本专利技术所具有的优点：本专利技术将抗生素的替代品抗菌肽首次导入水产养殖的饵料微藻中，从而获得新型的饵料微藻藻株。与其他饵料微藻相比，此藻株对水产养殖中的病原菌具有显著的抑制作用，可提高水产动物的抗病性，减少水产养殖病害的发生。与抗生素及化学药物等水产病害的防治方法相比，新型饵料微藻绿色无污染环保性能高，并且不会使致病菌产生耐药性。与此同时大部分的饵料微藻没有遗传转化的技术基础，很难实现外源基因的导入及外源蛋白的积累。并且大部分抗菌肽对微藻细胞有内毒性作用，抗菌肽的积累会对微藻产生抑制甚至致死效应。附图说明：图1A为本专利技术实施例提供的抗菌肽1的表达载体图谱结构图；图1B为本专利技术实施例提供的抗菌肽2的表达载体图谱结构图；图2为本专利技术实施例提供的亚心型四爿藻基因改良藻株抑菌实验结果图，其中，A、B、C分别为抑制副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌的平板，其中圆形标注为野生型亚心型四爿藻提取液；方形标注为CGMCCNo.16115提取液；椭圆形标注为CGMCCNo.16116提取液。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步描述新型饵料微藻的制备：1）人工合成两条短肽的核酸序列，然后插入到亚心型四爿藻细胞核表达载体中，从而获得外源蛋白表达载体；2）利用基因枪转化法将步骤1）获得的两个载体分别导入对数生长期的亚心型四爿藻中；3）将步骤2）中转化的三角亚心型四爿藻，经过除草剂草丁膦和抗生素卡那霉素共同筛选，存活下来的藻体进行继代培养；4）将步骤3）中存活下来的藻体，进行PCR检测和Southern杂交检测，以及基因表达绝对定量检测；5）将步骤4）中检测均表现为阳性的藻株在f/2培养液中扩大培养至对数期，而后离心收集藻体，超声破碎后收集上清液，利用抑菌板实验检测其抗菌性能，受试病原菌包含副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌；6）经以上检测为阳性的亚心型四爿藻，在含有30μg/ml除草剂草丁膦和100μg/ml卡那霉素的f/2固体平板上进行连续5代以上筛选，获得的两株具有抑菌活性的亚心型四爿藻改良藻株。实施例1亚心型四爿藻突变株的获得构建：1）亚心型四爿藻-抗菌肽表达载体的构建设计获得具有抗菌活性的两个小肽出发，抗菌肽序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2中所示的碱基序列；将两条人工合成序列分别插入到亚心型四爿藻表达载体【TS-SV40bar】中形成如附图1所示的载体，分别命名为TS-ANTI1（含序列SEQIDNo.1的抗菌肽），TS-ANTI2（含序列SEQIDNo.2的抗菌肽）；其中，载体TS-SV40bar详见YulinCui,LinQu,JialinZhao,SongQin.Transientexpressionoftheenhancedgreenfluroscenceprotein(egfp)geneinTetraselmissubcordiformi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型饵料微藻，其特征在于：新型饵料微藻为于2018年7月17号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的两株微藻，两株微藻的分类名称均为亚心型四爿藻，也称亚心型扁藻，拉丁名是Tetraselmis subcordiformis, 也可称为Platymonas subcordiformis；保藏编号分别为CGMCC No.16115和CGMCC No.16116。

【技术特征摘要】
1.一种新型饵料微藻，其特征在于：新型饵料微藻为于2018年7月17号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的两株微藻，两株微藻的分类名称均为亚心型四爿藻，也称亚心型扁藻，拉丁名是Tetraselmissubcordiformis,也可称为Platymonassubcordiformis；保藏编号分别为CGMCCNo.16115和CGMCCNo.16116。2.按权利要求1所述的新型饵料微藻，其特征在于：将SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽分别插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的所述保藏编号分别为CGMCCNo.16115和CGMCCNo.16116亚心型四爿藻突变株。3.按权利要求1所述的新型饵料微藻，其特征在于：将SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的所示氨基酸序列的抗菌肽依次插入亚心型四爿藻表达载体中，而后利用基因工程方法将载体导入亚心型四爿藻中，从而获得具有抗菌活性的亚心型四爿藻突变株。4.一种权利要求1所述的新型饵料微藻的构建方法，其特征在于：将SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的所示氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉琳，初金玲，秦松，胡章立，刘会会，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，深圳大学龙华生物产业创新研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37