检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术提供了检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用，属于生物检测和蛋白质技术领域。本发明专利技术提供的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，时效性高，能特异性的针对CYP2E1酶进行检测，专属性较强；能较好的避免被干扰，将特征肽段应用到检测大鼠CYP2E1酶中，效果明显；检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过本筛选方法，能获得特异性的片段。

【技术实现步骤摘要】
检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用
本专利技术涉及生物检测和蛋白质
，具体而言，涉及检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用。
技术介绍
肝脏中细胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)是许多内源性和外源性物质进行Ⅰ相代谢的主要酶类，其中CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A五大类参与了临床70～80％常用药物的代谢。CYP2E1是CYP2E家族中报道对药物影响最大的代谢酶。对于CYP2E1酶作用的药物，不同个体对同一药物剂量反应不同，甚至导致不可预见的药物不良反应及毒性，主要表现在酶基因多态性和含量差异性两个方面。其基因多态性已被广泛任何，但由于现有蛋白定量方法的缺陷，含量差异在药物对人体的作用研究相对较少。不同的研究机构对代谢酶的定量方法不全相同，主要包括定量RT-PCR、半定量RT-PCR从转录水平对mRNA定量分析，或以免疫组织化学技术(IHC)、免疫印迹法(WesternBlot)从翻译水平对相应蛋白质表达水平定量。但是由于mRNA的翻译水平调控以及蛋白质的翻译后转移和修饰受多种因素的影响，因此测得的mRNA的量不能准确代表药物代谢酶的表达水平。同时，由于外排蛋白具有高度的序列同源性，因此现有免疫印迹法缺乏专属性，伴有一定的抗原-抗体交叉反应，有可能形成非特异性的抗原抗体复合物，其掺杂在待测物与抗体形成的复合物间，从而导致错误结果的产生。探针底物法是测定酶的活性(从功能上分析)的方法，目前在评价细胞色素P450酶活性时采用最多的是“Cocktail”探针底物法，该方法选用主要经该酶代谢的药物作用底物，通过测试底物的减少量或代谢产物的生成量测试酶的活性。通过这种方法获得的结果具有间接性，并且往往涉及到大量样本的采集和测试，时效性差。难以重复。同时，同一个探针底物可被多个酶催化，同一个酶可催化众多化合物，因此，探针底物法的交叉反应使得方法准确性较差。已有少量国内外文献报道使用质谱技术绝对定量CYP450酶，但关于对CYP2E1酶的定量研究较少，现有的方法选出3-5条目标蛋白的肽段，将特征肽段串联，通过质粒转化、蛋白表达与纯化，用纯化后的蛋白作为标准品定量。但是该方法在筛选肽段时未用实际样本进行验证，仅借用软件筛选出特异性肽段，是否满足唯一性并能在仪器中有足够高的响应是在前期筛选无法确认的，同时，现有方法开发后未进行方法验证，仅用标曲完成样本定量，定量下限较高，灵敏度不够。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，该特征肽段能用于精确检测CYP2E1酶的含量，检测结果可靠。本专利技术的第二目的在于提供上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在大鼠CYP2E1酶定量检测的应用。本专利技术的第三目的在于提供检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过该筛选方法，能筛选得到特异性的肽段。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示；标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，第一标记肽段和第二标记肽段为同位素标记；延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，第一延长肽段和第二延长肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.3-4所示。上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在CYP2E1酶定量检测的应用。检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，筛选方法包括以下步骤：取大鼠CYP2E1酶液待测样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后用水漂洗SDS-PAGE凝胶，再用固定液处理，得到固定液凝胶；用考马斯亮蓝染色固定液凝胶得到染色凝胶，用水清洗染色凝胶并用脱色液处理；将染色的蛋白条带切下，并切碎成胶粒，再加入脱色液处理后用乙腈脱水，用还原液水浴处理后，加入蛋白保护液处理后，再次加入250μL还原液室温处理，得到还原胶粒；干燥还原胶粒。并加入酶处理18h，并通过ZipTipC18柱脱盐处理，得到脱盐样本；将脱盐样本干燥浓缩并加入0.1％甲酸溶液混悬，得到样本混悬液；将样本混悬液通过液相色谱系统和质谱系统分析，获得肽段信息，分析并获得目标肽段信息，合成得到特征肽段。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，时效性高，能特异性的针对CYP2E1酶进行检测，专属性较强；能较好的避免被干扰，将特征肽段应用到检测大鼠CYP2E1酶中，经方法学验证显示，定量肽段1与定量肽段2在2～320ng/mL的范围内均线性良好，定量下限可达2ng/mL，灵敏度高，满足样本测试要求。质控浓度样本测量值偏差在±15％以内，RSD值不大于6.7％。肽段经酶解后于进样器条件下存放24h，-20℃保存20d，-20℃冻融三次均稳定；检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，通过本筛选方法，能获得特异性的片段，并将建立的方法成功用于定量大鼠肝微粒体CYP2E1酶的表达量。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段及其筛选方法与应用进行具体说明。同一蛋白，选用不同的特征肽段，可能导致定量结果不同。这是由于不同肽段的酶解效率是存在差异的，为了验证肽段的选择对测试结果的影响，本研究筛选了大鼠CYP2E1酶的2条特征肽段进行方法开发。检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，第一定量肽段和第二定量肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示；标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，第一标记肽段和第二标记肽段为同位素标记；延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，第一延长肽段和第二延长肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.3-4所示。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，第一标记肽段的同位素标记方式为：FINL(13C615N1)VPSNLPHEATR；第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C615N1)FNNGPTWK。实际上，本方案中，肽段的标记还可以是其他类的标记，也可以是其他位置的氨基酸的标记。上述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在大鼠CYP2E1酶定量检测的应用。检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，筛选方法包括以下步骤：取大鼠CYP2E1酶液待测样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后用水漂洗SDS-PAGE凝胶，再用固定液处理，得到固定液凝胶；用考马斯亮蓝染色固定液凝胶得到染色凝胶，用水清洗染色凝胶并用脱色液处理；将染色的蛋白条带切下，并切碎成胶粒，再加入脱色液处理后用乙腈脱水，用还原液水浴处理后，加入蛋白保护液处理后，再次加入250μL还原液室温处理，得到还原胶粒；干燥还原胶粒，并加入酶处理18h，并通过ZipTipC18柱脱盐处理，得到脱盐样本；将脱盐样本干燥浓缩并加入0.1％甲酸溶液混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，其特征在于，所述特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；所述定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，所述第一定量肽段和所述第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示；所述标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，所述第一标记肽段和所述第二标记肽段为同位素标记；所述延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，所述第一延长肽段和所述第二延长肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3‑4所示。

【技术特征摘要】
1.检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，其特征在于，所述特征肽段包括定量肽段、标记肽段和延长肽段；所述定量肽段包括第一定量肽段和第二定量肽段，所述第一定量肽段和所述第二定量肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1-2所示；所述标记肽段包括第一标记肽段和第二标记肽段，所述第一标记肽段和所述第二标记肽段为同位素标记；所述延长肽段包括第一延长肽段和第二延长肽段，所述第一延长肽段和所述第二延长肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.3-4所示。2.根据权利要求1所述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段，其特征在于，所述第一标记肽段的同位素标记方式为：FINL(13C615N1)VPSNLPHEATR；所述第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C615N1)FNNGPTWK。3.如权利要求1或2所述的检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段在CYP2E1酶定量检测的应用。4.检测大鼠CYP2E1酶的特征肽段的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：取大鼠CYP2E1酶液待测样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后用水漂洗所述SDS-PAGE凝胶，再用固定液处理，得到固定液凝胶；用考马斯亮蓝染色所述固定液凝胶得到染色凝胶，用水清洗所述染色凝胶并用脱色液处理；将染色的蛋白条带切下，并切碎成胶粒，再加入脱色液处理后用乙腈脱水，用还原液水浴处理后，加入蛋白保护液处理后，再次加入250μL所述还原液室温处理，得到还原胶粒；干燥所述还原胶粒，并加入酶处理18h，并通过ZipTipC18柱脱盐处理，得到脱盐样本；将所述脱盐样本干燥浓缩并加入0.1％甲酸溶液混悬，得到样本混悬液；将所述样本混悬液通过液相色谱系统和质谱系统分析，获得大鼠CYP2E1酶的体征肽段及其氨基酸序列，分析并获得目标肽段信息，合成得到特征肽段。5.根据权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：余鹏，邱朝辉，孟凡奇，蒋蕾，丁尧，张可，
申请(专利权)人：余鹏，
类型：发明
国别省市：湖南,43