本发明专利技术涉及枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能，即在抗疮痂链霉菌中的应用。本发明专利技术还提供了来自于枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。本发明专利技术发现了已知的枯草芽孢杆菌GGT蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。
New Functions of GGT Protein Degradation Products from Bacillus subtilis and Identification of Antimicrobial Peptides
The present invention relates to a new function of GGT protein degradation product of Bacillus subtilis, i.e. its application in anti-scab streptomyces. The invention also provides an antimicrobial peptide derived from Bacillus subtilis GGT protein. The invention discovers that the known Bacillus subtilis GGT protein has anti-scab Streptomyces activity after degradation, and further identifies the antimicrobial peptide sequence from the degradation product of Bacillus subtilis GGGT protein, which provides a new idea for the biological control of potato scab.
【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定
本专利技术属于植物保护与生物防治领域，涉及一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定。
技术介绍
马铃薯作为我国的主要粮食作物被广泛种植，仅次于水稻、小麦和玉米，近年来逐渐成为很多省份的重要经济来源，而优质的马铃薯种薯则是这一经济来源的基础。马铃薯疮痂病主要在土壤中进行传播，在马铃薯种植过程中极易感染，近年来由疮痂链霉菌引起的马铃薯疮痂病日益严重，直接影响马铃薯的品质，使马铃薯产业产生了巨大的经济损失。病原微生物造成的植物病害严重地阻碍了我国农业的发展。化学农药的大量使用不仅会对环境造成严重的污染，还会使人类的健康受到威胁。近年来，越来越多的生防菌株被研究并初步应用到植物病害的生物防治中，取得了较好的防效，发展前景广阔。大部分生防菌株依靠自身产生的活性物质实现对病原菌的抑制，其中抗菌肽(Antimicrobialpeptide，AMP)就是一类比较有代表性的活性物质，也是生物体先天免疫系统的重要组成部分。多年以来，人们从不同种类的生物体中发现了大量的未知抗菌肽，它们是一类带正电荷的两亲性小分子抗菌肽。这种小分子抗菌肽对细菌和病毒均具有抵抗作用，从而使病原不能够侵入细胞内部。此外它们还具有清除体内突变细胞的功能。芽孢杆菌是一种理想的生防微生物，对高温、紫外线和酸碱环境均具有一定的耐受性，能够有效抑制多种病原菌，对病害起到良好的防治效果。目前，已出现多种芽孢杆菌与生物防治相关的报道，包括蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等。此外，芽孢杆菌产生的抗菌物质如多肽、多糖、次生代谢物、抗菌蛋白等，是其拮抗病原菌的主要物质基础。但由于芽孢杆菌的种类众多，其生防效果及产生的抗菌物质均存在较大差异，因此来自于芽孢杆菌的抗菌物质仍有待进一步开发。γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase，GGT)分布非常广泛，从细菌到哺乳动物体内都有存在。该酶能催化3种类型的反应：转肽反应、自转肽反应和γ-谷氨酰基的水解反应。GGT在临床检测中可作为生物标志物，已经用作肝脏和其他疾病的常规检测指标。该酶在生物催化合成中也有相当重要的应用，利用此酶可以合成多种含γ-谷氨酰基的化合物。GGT蛋白具有信号肽，为细胞外分泌表达，在翻译后修饰过程中会自发进行剪切成为大小两个亚基，分子量分别约为40kDa和20kDa。在芽孢杆菌的培养过程中，在上清液中能够长时间检测到该酶及其降解片段的大量存在，但并没有关于该酶及其降解片段与抑菌活性相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是鉴定枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能，其降解产物具有对疮痂链霉菌具有抗菌活性。本专利技术的第二目的是提供一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。本专利技术的第三目的是提供另一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。本专利技术通过以下技术方案来实现：一、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物具有对疮痂链霉菌的抑菌活性。二、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。三、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。上述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。首先对枯草芽孢杆菌的培养液上清进行硫酸铵沉淀和离子交换层析，对于分离到的蛋白质组分，检测其对疮痂链霉菌的抗菌活性。具有抗菌活性的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳，切取蛋白质条带进行质谱测序。测序结果经数据库比对分析确认蛋白质组分为γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的组成部分，从而推测枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物具有抗菌活性。随后通过抗菌肽在线预测的方法分析枯草芽孢杆菌的GGT蛋白质序列，预测得到多种抗菌肽，选取3种抗菌肽进行多肽合成和活性测试，最终确认2条对疮痂链霉菌具有抑菌活性的抗菌肽SEQIDNO:1(IQKDLAKTFKLIRSNGTDAF)和SEQIDNO:2(ATIISSVLQTILYHIEYGMELKAAVE)。采用上述技术方案的积极效果：本专利技术发现了已知的枯草芽孢杆菌GGT蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。附图说明图1为枯草芽孢杆菌抑菌物质的阴离子交换层析图谱，P1、P2、P3：分别为三个洗脱峰；图2为枯草芽孢杆菌不同分离组分对疮痂链霉菌的活性测试，CK：对照，1：培养液上清，2：硫酸铵沉淀组分，3：离子交换层析洗脱峰P1，4：离子交换层析洗脱峰P2，5：离子交换层析洗脱峰P3；图3为离子交换洗脱峰P2的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白质分子量Marker，1：离子交换洗脱峰P2，b3：离子交换洗脱峰P2中的目的蛋白质条带；图4为蛋白质条带b3进行Maldi-TOF质谱测序分析得到的质谱图；图5为质谱测序结果进行Mascot比对得到的最优结果：γ-谷氨酰转肽酶，GenBank登录号为KIU12867.1；图6为在线预测获得的3种GGT蛋白的抗菌肽在三维结构中的定位，AE26、LT30、IF20分别为预测的抗菌肽，都为α-螺旋；图7为3种预测抗菌肽对疮痂链霉菌的抗菌活性测试结果；图8为枯草芽孢杆菌GGT蛋白两个亚基的重组表达蛋白在不同时间内的降解情况，M：蛋白质分子量Marker，1-9：分离纯化1-9小时后的蛋白质样品，GGT-A：GGT蛋白大亚基(36-402氨基酸)，GGT-B：GGT蛋白小亚基(403-587氨基酸)。图9为枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的抗菌活性测试结果，1：降解0小时的GGT蛋白样品，2：降解9小时后的GGT蛋白样品。具体实施方式以下通过实施例来进一步描述本专利技术，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本专利技术的范围。本专利技术中生物材料的来源：1、所用的枯草芽孢杆菌BU412于2016年3月23日中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2016142；2、疮痂链霉菌，普城沙雷氏菌BU09的分离鉴定及其对疮痂链霉菌的防治效果，安徽农业科学，2017年第45卷11期，123-124页，作者：张竹君，刘权，该菌种一直保存在黑龙江八一农垦大学，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；3、抗菌肽为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。实施例1枯草芽孢杆菌GGT蛋白的分离纯化与质谱鉴定。将枯草芽孢杆菌BU412接种至YME液体培养基(麦芽糖10g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖4g/L、pH7.5)进行过夜培养，12000g离心收集上清，使用80％的硫酸铵沉淀得到蛋白组分，使用20mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液溶解沉淀，经过0.22μm的滤膜过滤，使用AKTA蛋白纯化仪进行阴离子交换层析，使用的纯化柱为GE公司的Qhp阴离子交换柱(柱体积为5mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH7.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物在抗疮痂链霉菌中的应用。
【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物在抗疮痂链霉菌中的应用。2.一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘权，殷奎德，申永瑞，宋烨，向君亮，王佳琦，张竹君，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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