筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法。本发明专利技术提供了一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。本发明专利技术提取了结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白，并进一步与HuProt

Screening of Human Ligand Proteins Specifically Targeting Mycobacterium Tuberculosis

The invention discloses a method for screening human ligand proteins specifically targeting Mycobacterium tuberculosis. The present invention provides a method for screening human proteins capable of interacting with tuberculosis proteins, including the following steps: hybridization of Mycobacterium tuberculosis-derived bacterial proteins and secretory proteins with human protein chips, and determination of interacting with the bacterial proteins and/or secretory proteins based on the results of hybridization. Human protein for use. The present invention extracts Mycobacterium tuberculosis body protein and secretory protein, and further with HuProt.

【技术实现步骤摘要】
筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法。
技术介绍
结核病仍然是严重威胁人类健康、流行性最广、病死率最高的传染性疾病之一，每年全球约有1000万新发病例，160万人死亡，死亡人数居单一传染病之首。作为结核病的致病菌，结核分枝杆菌经过长期的演化已进化为非常成功的一种胞内致病菌。结核分枝杆菌通过呼吸道进入人体后，主要寄生于巨噬细胞内，并通过其多种策略逃避宿主细胞的免疫杀伤作用，可以在巨噬细胞内缓慢复制、长期存活，最终产生持留状态。当宿主免疫力低下时，休眠的结核分枝杆菌可以重新活化，导致机体发展为活动性结核病。结核分枝杆菌从进入宿主细胞直至宿主发病的过程中，激发了宿主体内复杂的免疫反应，一方面通过调节宿主免疫系统的平衡，使之更加适合于其在宿主体内寄生，另一方面在合适的环境下又可快速繁殖引发结核病，甚至最终导致宿主死亡。然而，结核病的感染及致病的分子机制依然不清楚。但毋容置疑的是，结核病感染和发病的过程也是结核分枝杆菌和宿主之间发生复杂的相互作用的过程，能够与结核分枝杆菌直接相互作用的宿主蛋白质是结核感染和致病的桥梁和关键，鉴定出这些特异性的人蛋白，将有助于深入揭示结核病发病的分子机制，也可为结核病的诊断和治疗提供潜在的药物靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法，以及所筛选到的人类蛋白的相关应用。第一方面，本专利技术要求保护一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法。本专利技术所提供的筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，可包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。在所述方法中，来源于所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)结核分枝杆菌菌体蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的菌体重悬于PBS中，然后经反复冻融、超声、离心，所得上清即为含有所述菌体蛋白的溶液。进一步地，将所述结核分枝杆菌的菌体重悬于PBS中之前，还可包括如下步骤：用PBS洗涤所述结核分枝杆菌的菌体(如洗涤2次)。所述反复冻融的次数可为3次。所述超声的条件可为：P＝800W，超声2秒，间歇2秒，共40分钟。所述离心的条件可为4℃12000rpm离心10分钟。(2)结核分枝杆菌分泌蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌后进行超滤，超滤管中截留的液体即为含有所述分泌蛋白的溶液。进一步地，将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌时可采用0.22μm滤器。进行所述超滤时可采用离心超滤管(3KD)。在进行所述超滤之后还可包括用PBS洗涤的步骤(如洗3次)。更进一步地，在对所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白进行提取前还可包括如下步骤：将所述结核分枝杆菌接种到7H9液体培养基(美国BD公司，货号271310，含10％促生长添加剂OADC、0.5％吐温-80，％表示体积百分含量)中培养至对数生长期，然后进行灭活处理，离心收集上清和菌体；所述上清即为步骤(2)中的所述结核分枝杆菌的培养上清，所述菌体即为步骤(1)中的所述结核分枝杆菌的菌体。更加具体的，将所述结核分枝杆菌接种到所述7H9液体培养基中培养至对数生长期可为将所述结核分枝杆菌接种到所述7H9液体培养基中37℃培养3周。所述灭活处理可为90℃水中10分钟灭活。所述离心可为2000rpm离心10分钟。在所述方法中，将所述菌体蛋白和所述分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交是按照包括如下步骤的方法进行的：(1)封闭：将所述人类蛋白芯片置于封闭液(含5％BSA的TBST溶液，％表示g/100ml)中室温孵育1.5-2小时，在振荡器上摇动(60rpm)；(2)蛋白样品准备：将所述菌体蛋白和所述分泌蛋白分别用封闭液稀释到终浓度1μg/ml，混匀，避光，冰上保存；(3)蛋白样品与芯片杂交：将5ml步骤(2)准备好的蛋白样品加到步骤(1)封闭好的所述人类蛋白芯片上，室温摇动孵育2h，避光；(4)洗片：用TBST溶液和ddH2O先后洗涤步骤(3)处理过的所述人类蛋白芯片，避光；(5)干片、扫描；(6)数据分析：扫描获得的图像用GenePixPro软件分析获得原始数据，然后用信噪比(SNR：净信号值除以背景的比值)评价该点阳性的水平，若SNR>2，则认为这个蛋白是阳性信号点。进一步地，所述人类蛋白芯片为HuProtTM人类蛋白芯片。所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌实验室标准株H37Rv。在本专利技术的具体实施方式中，最终所得的能够与所述结核蛋白相互作用的人类蛋白共84个，具体如下文所示。第二方面，本专利技术要求保护84个人类蛋白中的全部或部分在与结核蛋白互作中的应用。其中，所述84个人类蛋白为OVOL1(5017)，ARID3A(1820)，RNF113B(140432)，SMAD2(4087)，NRF1(4899)，SRCAP(10847)，ZNF699(374879)，SP6(80320)，DPRX(503834)，INSM1(3642)，ZNF253(56242)，ZNF410(57862)，SMAD4(4089)，HOXB5(3215)，SRY(6736)，KLF8(11279)，ZNF570(148268)，ZNF700(90592)，HOXB9(3219)，ESRRG(2104)，ZNF557(79230)，ZNF23(7571)，ZNF100(163227)，ZNF337(26152)，ZNF343(79175)，IKZF3(22806)，STAT5B(6777)，MAP2K5(5607)，GMEB2(26205)，FOXM1(2305)，SKOR2(652991)，VENTX(27287)，ZBTB12(221527)，ZNF425(155054)，TSC22D4(81628)，GLIS2(84662)，ZNF136(7695)，ZNF569(148266)，HOXB4(3214)，MTA2(9219)，ZNF541(84215)，KLF11(8462)，ZNF540(163255)，RORA(6095)，NFE2L2(4780)，HNF4A(3172)，PCK2(5106)，MBTPS1(8720)，MAPK3(5595)，VPS8(23355)，LAPTM4A(9741)，PPCDC(60490)，SGCA(6442)，BCL2L14(79370)，SLC39A8(64116)，SF3B2(10992)，GLO1(2739)，ITM2B(9445)，CSRP2BP(57325)，NDUFB6(4712)，CYP39A1(51302)，RFC4(5984)，PARVA(55742)，CD300LB(124599)，GNB1L(54584)，CPA1(1357)，LDHA(3939)，CDX2(1045)，SOX4(6659)，ACP1(52)，ZNF70(7621)，MBD2(8932)，BARX2(8538)，IKZF4(64375)，PPARD(5467)，IRF2(3660)，ZFP91(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：来源于所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)结核分枝杆菌菌体蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的菌体重悬于PBS中，然后经反复冻融、超声、离心，所得上清即为含有所述菌体蛋白的溶液；(2)结核分枝杆菌分泌蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌后进行超滤，超滤管中截留的液体即为含有所述分泌蛋白的溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述反复冻融的次数为3次；和/或所述超声的条件为：P＝800W，超声2秒，间歇2秒，共40分钟；和/或所述离心的条件为4℃12000rpm离心10分钟；和/或步骤(2)中，将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌时采用0.22μm滤器；和/或进行所述超滤时采用3KD离心超滤管；和/或在进行所述超滤之后还包括用PBS洗涤的步骤；和/或在对所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白进行提取前还包括如下步骤：将所述结核分枝杆菌接种到7H9液体培养基中培养至对数生长期，然后进行灭活处理，离心收集上清和菌体；所述上清即为步骤(2)中的所述结核分枝杆菌的培养上清，所述菌体即为步骤(1)中的所述结核分枝杆菌的菌体；和/或所述人类蛋白芯片为HuProtTM人类蛋白芯片；和/或所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌标准株H37Rv。4.84个人类蛋白中的全部或部分在与结核蛋白互作中的应用；所述84个人类蛋白为ZNF70、MBD2、BARX2、IKZF4、PPARD、IRF2、ZFP91、SOX10、FOXD3、GRM8、OVOL1、ARID3A、KIAA2018、RNF113B、SMAD2、NRF1、SRCAP、ZNF699、SP6、DPRX、INSM1、ZNF253、ZNF410、SMAD4、HOXB5、SRY、KLF8、ZNF570、ZNF700、HOXB9、ESRRG、ZNF557、ZNF23、ZNF100、ZNF337、ZNF343、IKZF3、STAT5B、MAP2K5、GMEB2、FOXM1、SKOR2、VENTX、ZBTB12、ZNF425、TSC22D4、ZNF136、ZNF569、HOXB4、MTA2、ZNF541、KLF11、ZNF540、GLIS2、RORA、NFE2L2、HNF4A、PCK2、MBTPS1、MAPK3、VPS8、BAT1、LAPTM4A、PPCDC、SGCA、BCL2L14、SLC39A8、FLJ20366、SF3B2、GLO1、ITM2B、CSRP2BP、NDUFB6、CYP39A1、RFC4、PARVA、CD300LB、GNB1L、CPA1、C6orf166、LDHA、CDX2、SOX4和ACP1。5.84个人类蛋白中的全部或部分在如下任一中的应用：(A1)检测结核蛋白；(A2)制备用于检测结核蛋白的产品；所述84个人类蛋白为ZNF70、MBD2、BARX2、IKZF4、PPARD、IRF2、ZFP91、SOX10、FOXD3、GRM8、OVOL1、ARID3A、KIAA2018、RNF113B、SMAD2、NRF1、SRCAP、ZNF699、SP6、DPRX、INSM1、ZNF253、ZNF410、SMAD4、HOXB5、SRY、KLF8、ZNF570、ZNF700、HOXB9、ESRRG、ZNF557、ZNF23、ZNF100、ZNF337、ZNF343、IKZF3、STAT5B、MAP2K5、GMEB2、FOXM1、SKOR2、VENTX、ZBTB12、ZNF425、TSC22D4、ZNF136、ZNF569、HOXB4、MTA2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹廷明，吕翎娜，张宗德，
申请(专利权)人：北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11