一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法，所述山核桃嫁接接合部中含有202个琥珀酰化的蛋白。其中所述琥珀酰化蛋白的GO分类分别属于代谢过程、细胞过程、单物种过程、刺激响应、蛋白定位、蛋白结合、催化活性、氧化还原活性；所述蛋白分别定位于叶绿体、细胞质、细胞核、线粒体、细胞质膜、液泡膜、细胞间质或内质网中。本发明专利技术首次发现了山核桃嫁接后，共有202个蛋白质及259个位点可以被琥珀酰化，这些参与多种生物学过程的琥珀酰化蛋白质，可以用作山核桃嫁接成功的鉴定标准。

A Method for Determining the Successful Grafting Rate of Carya cathayensis by Proteome Succinylation Analysis

The invention provides a method for judging the grafting success rate of hickory by proteome succinylation analysis. The grafting part of hickory contains 202 succinylated proteins. The GO classification of succinylated proteins belongs to metabolic process, cell process, single species process, stimulation response, protein localization, protein binding, catalytic activity and redox activity, respectively; the proteins are located in chloroplasts, cytoplasm, nucleus, mitochondria, plasma membrane, vacuole membrane, interstitial or interstitial cells, respectively. Endoplasmic reticulum. After grafting, 202 proteins and 259 sites can be succinylated. These succinylated proteins involved in various biological processes can be used as identification criteria for successful grafting of hickory.

【技术实现步骤摘要】
一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法
本专利技术属于植物培养领域，具体涉及一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法。
技术介绍
山核桃(CaryacathayensisSarg.)，又名小核桃、山蟹(浙江)、核桃、野漆树(安徽)，是一种落叶乔木，属胡桃科山核桃属，适生于山麓疏林中或腐殖质丰富的山谷，中国为原产地之一。成年山核桃树高达10-20米，胸径30-60厘米；树皮平滑，灰白色；小枝细瘦，新枝密被盾状着生的橙黄色腺体，后来腺体逐渐稀疏；1年生枝紫灰色，上端常被有稀疏的短柔毛；皮孔圆形，稀疏。山核桃的果实由于具有极高的营养价值和独特的口感风味，得到了消费者的认可，逐渐成为一种广受欢迎的高档坚果。山核桃果仁中含有7.8-9.6％的蛋白质，人体必需的氨基酸占7种以上且含量高达25％以上，还含有22种人体所需的微量元素，其中钙、镁、磷、锌、铁含量十分丰富。据资料分析，每公斤核桃仁等于9公斤鲜牛奶或5公斤鸡蛋、2公斤牛肉的营养价值，而且它较牛奶、鸡蛋、牛肉的营养易为人体吸收。山核桃核仁松脆味甘，香气逼人，可榨油、炒食，也可作为制糖果及糕点的佐料。核仁还具有润肺补气、养血平喘、润燥化痰、去虚寒之功效。山核桃是我国特有的珍贵坚果和木本油料树种，主要分布在浙江省的杭州市临安区和安徽省的宁国市、绩溪县等地。山核桃由于单宁含量高、髓心大、形成层薄，采用本砧和一般嫁接技术嫁接，选择生活力强的砧木和接穗嫁接后形成新的山核桃植株，能够缩短结果周期。然而，目前本砧和一般嫁接技术嫁接的周期长，嫁接成功率低，特别是嫁接过程无法监测，导致难以对嫁接效果进行预测与干预。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法，所述山核桃嫁接接合部中含有以下琥珀酰化蛋白，所述琥珀酰化蛋白在GenBank中的索引号为：优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述蛋白的琥珀酰化位点为以下表格所示，其中右栏数字表示琥珀酰化位点在左栏中蛋白的第几号氨基酸：优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化的蛋白分别属于代谢过程、细胞过程、单物种过程、刺激响应、蛋白定位、蛋白结合、催化活性、氧化还原活性等GO分类。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化的蛋白分别定位于叶绿体、细胞质、细胞核、线粒体、细胞质膜、液泡膜、细胞间质或内质网等亚细胞器中。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化的蛋白分属于内质网代谢过程、糖酵解、碳代谢、甲基丙酸代谢、氨基酸生物合成、植物-病原菌互作、戊糖磷酸途径、碳固定、次生代谢产物合成等KEGG代谢途径。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化的蛋白中含有4种琥珀酰化特异结合位点的motif类型，分别是：······KP······、······K·E·········、······E··KK······和······K·D······。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述······KP······、······K·E·········、······E··KK······和······K·D······4种琥珀酰化特异结合位点motif类型的匹配系数分别为16.00、16.00、17.50和9.98。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化蛋白中包括7个糖酵解相关酶，所述糖酵解相关酶分别为PGM(EC:5.4.2.2)、葡糖-6-磷酸1-异构酶(EC:5.1.3.15)、ALDO(EC:4.1.2.13)、PGK(EC:2.7.2.3)、ENO(EC:4.2.1.11)、DLD(EC:1.8.1.4)和ADH(EC:1.1.1.1)。优选地，本专利技术所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，所述琥珀酰化蛋白中包括5个磷酸戊糖途径相关酶，所述磷酸戊糖途径相关酶包括：G6PD(EC:1.1.1.49)、G6PD(EC:1.1.1.363)、TKT(EC:2.2.1.1)、ALDO(EC:4.1.2.13)和PGM(EC:5.4.2.2)。本专利技术的另一方面为提供一种琥珀酰化蛋白，包括以下蛋白组成的组：本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：本专利技术得到了在山核桃嫁接后琥珀酰化的202个蛋白质，并鉴定获得了259个琥珀酰化位点，这些蛋白质参与了多种生物学过程，可以用于作为鉴定山核桃嫁接成功的鉴定标准。附图说明图1为山核桃琥珀酰化蛋白的GO分类结果示意图；图2为山核桃琥珀酰化蛋白的亚细胞定位分析图；图3为山核桃琥珀酰化蛋白的富集分析图；图4为山核桃琥珀酰化蛋白的KEGG代谢途径富集分析图。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1山核桃嫁接成活过程琥珀酰化蛋白种类与位点以山核桃嫁接接合部作为本次研究的实验材料，所述实验材料来源于2年生砧木与1年生接穗的嫁接苗，取样部位为砧木和接穗相接的部位，嫁接方法为切接，取样时间为嫁接后0天和7天，取样时用刀片刮取砧木和接穗接合面的细胞，提取蛋白质，测序。通过高效液相结合串联质谱的方法，在202个蛋白质中一共鉴定得到259个琥珀酰化位点。这些蛋白质参与了多种生物学过程，具有广泛的代表性。同时，完成了对山核桃琥珀酰化蛋白的差异表达分析，设置1.2倍为上调蛋白的阈值，0.83为下调蛋白的阈值。其中，具体方法如下：1.山核桃嫁接接合部蛋白的提取将山核桃嫁接接合部的材料取下，快速冻于液氮中，-80℃冰箱保存备用。实验开始时，取出冷冻保存的样本，将材料在液氮中研磨粉碎后转移至5mL离心管中，在冰上混匀三次，使用高强度裂解仪在裂解缓冲液中进行裂解。使用的裂解液需提前添加蛋白酶抑制剂。剩下的残留物通过高速离心机，在20000rpm的转速下，4℃离心去除。最后得到的蛋白质在提前预冷的15％TCA缓冲液中沉淀保存。通过4℃10分钟的高速离心，将上清液去除，得到的沉淀物即为所需的蛋白质。得到的蛋白质沉淀物通过冰醋酸清洗三遍后备用。得到的蛋白质沉淀物再一次溶解于缓冲液中，蛋白质的浓度通过一个2-D定量试剂盒进行检测，检测方法参见所用试剂盒的说明书。2.使用裂解酶裂解步骤1获得的蛋白溶液通过10mM的DTT在37℃下一个小时进行还原，再通过20mMIAA在室温下45分钟暗处理进行碱化。以上两步确保蛋白液完成降解。为了完成蛋白质的降解，蛋白样本重新溶解于添加了100mMTEAB缓冲液的溶液中。最后裂解酶按照裂解酶与蛋白质1:50的比例进行第一轮过夜裂解。然后按照裂解酶与蛋白质1:100的比例进行第二轮四小时裂解。3.亲和富集为了富集所有琥珀酰化的肽段，已完成裂解的肽段溶解于NETN缓冲液中，并和预洗的抗体珠一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法，其特征在于，所述山核桃嫁接接合部含有以下琥珀酰化蛋白，所述琥珀酰化蛋白在GenBank中的索引号为：

【技术特征摘要】
1.一种利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法，其特征在于，所述山核桃嫁接接合部含有以下琥珀酰化蛋白，所述琥珀酰化蛋白在GenBank中的索引号为：2.根据权利要求1所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，其特征在于，所述蛋白的琥珀酰化位点为以下列表中的位置：3.根据权利要求1所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，其特征在于，所述琥珀酰化蛋白分别属于代谢过程、细胞过程、单物种过程、刺激响应、蛋白定位、蛋白结合、催化活性、氧化还原活性等GO分类。4.根据权利要求1所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，其特征在于，所述琥珀酰化蛋白分别定位于叶绿体、细胞质、细胞核、线粒体、细胞质膜、液泡膜、细胞间质或内质网等亚细胞器中。5.根据权利要求1所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，其特征在于，所述琥珀酰化蛋白分属于内质网代谢过程、糖酵解、碳代谢、甲基丙酸代谢、氨基酸生物合成、植物-病原菌互作、戊糖磷酸途径、碳固定、次生代谢产物合成等KEGG代谢途径。6.根据权利要求1所述的利用蛋白质组琥珀酰化分析判断山核桃嫁接成功率的方法中，其特征在于，所述琥珀酰化蛋白中含有4种琥珀酰化特异结合位点的motif类型，分别是：……KP……、……K·E…...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炳松，袁虎威，闫道良，何漪，沈晨佳，陈娟娟，杨影，徐栋斌，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33