检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法。本发明专利技术提供的一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，用于检测L858R的包括第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对；用于检测Del19的包括第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对。该引物组合物可以检测样本中的L858R是否发生点突变和Del19是否外显子缺失，稳定性好，准确性高，即便是血液样本也可以达到0.01％的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法。
技术介绍
全球范围内由癌症引起的死亡案例中，肺癌占其主导原因，其中85％的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。表皮生长因子受体(EGFR)的突变，包括氨基酸L858R的替换，是评价第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在NSCLC治疗中的重要指标。因此，在决定治疗策略前，进行EGFR基因突变的检测是非常有必要的。通常，肿瘤组织作为检测的首选推荐，但是肿瘤组织并非在所有的情况下都能获取，所以对血液样本进行检测相对于肿瘤组织检测具有巨大的检测优势。通过使用血液样本中的cfDNA检测EGFR突变的情况可以实现侵入性极小的检测。血浆中EGFR的突变丰度来源于肿瘤组织，主要为肿瘤坏死凋亡后释放到外周血中的cfDNA。由于血浆中EGFR的突变丰度与肿瘤组织中的突变丰度有关，所以，血浆中cfDNA的EGFR突变情况能够用来预测NSCLC患者使用EGFR-TKIs的治疗情况。市面上已有多项EGFR突变检测方法，用来预测EGFR靶向抑制剂疗法的响应率。1)荧光原位杂交(FISH)对于晚期NSCLC病人接受EGFR抑制剂的生存获益有着良好的预测，但荧光原位杂交花费较多的时间和精力，成本昂贵。2)标准化的DNA测序只能够检测突变丰度为10％-25％的肿瘤，同时检测的质量取决于肿瘤和基因组的材料，误差较大。3)扩增阻碍突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)通常只能检测到1％的突变。4)荧光定量PCR被广泛运用到EGFR基因突变评估的临床检测中，但是同样灵敏度低、准确性差。2013年，FDA批准了罗氏EGFR基因突变组织样本检测的试剂盒。尽管基于组织的检测方法有着广泛的应用，组织样本并不是每次都能获取。组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。因此，众多研究都希望能找到一种可替代的方法来检测EGFR突变。血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。因为肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血，肿瘤患者血浆中的cfDNA含量将显著高于健康人群血浆中的含量。因此，通过分离血浆中肿瘤DNA实现此项诊断检测是可行的。EGFR突变主要发生在18-21号外显子，其中，19外显子缺失突变(exon19deletions，简称Del19)和21外显子的点突变(简称L858R)统称为EGFR常见突变或经典突变，占EGFR总突变的90％。对EGFRDel19和L858R进行检测对肺癌治疗和癌症的发现具有重要的参考价值，但是目前本领域还是缺乏低成本、高灵敏度和高准确性的Del19和L858R检测技术。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，本专利技术的第二目的在于提供一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂，本专利技术的第三目的在于提供一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂盒，本专利技术第四目的在于提供上述试剂盒的应用，本专利技术的第五目的在于提供一种检测EGFR基因L858R和Del19突变的方法，本专利技术的第六目的在于提供表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法，以缓解现有技术中检测Del19和L858R的方法需要组织样本，不能做到微创，成本过高同时灵敏度和准确性差的技术问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，所述引物组合物包括：用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对；和，用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对；其中，所述第一野生型基因探针如SEQIDNO.1所示；所述第一突变型基因探针如SEQIDNO.2所示；所述第一引物对如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述第二野生型基因探针如SEQIDNO.5所示；所述第二突变型基因探针如SEQIDNO.6所示；所述第二引物对如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。进一步地，所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针均独立地于5’端结合荧光基团，于3’端结合淬灭基团；所述第一野生型基因探针和所述第一突变型基因探针的荧光基团不同；所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的荧光基团不同。进一步地，所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的3’端均独立地3结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX；优选地，所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ，优选为NFQ。进一步地，所述第一野生型基因探针和所述第二野生型基因探针的5’端均独立地结合VIC荧光基团，所述第一突变型基因探针和所述第二突变型基因探针的5’端均独立地结合FAM荧光基团。一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂，所述试剂包括上述引物组合物。一种用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂盒，包括上述引物组合物或上述试剂；进一步地，还包括ddPCRMasterMix。上述试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del19突变中的应用；或，在检测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变中应用。应用上述引物组合物或上述试剂或上述试剂盒检测EGFR基因L858R和Del19突变率的方法，将从全血样本中提取的DNA样本与上述引物组合物或上述试剂进行ddPCR反应，EGFR基因L858R和Del19突变率均独立地根据突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)×100％得到。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法，采用上述方法，根据EGFR基因L858R和Del19突变判断表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，用于检测L858R的包括第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对；用于检测Del19的包括第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对。该引物组合物可以检测样本中的L858R是否发生点突变和Del19是否外显子缺失，稳定性好，准确性高，即便是血液样本也可以达到0.01％的灵敏度。由于该引物组合物中的探针和引物特异性好，避免了患者组织样本提取的难度和成本，做到微创对血液进行检测就可以评价EGFR基因的突变情况，极大地降低了检测成本。本专利技术提供的用于检测EGFR基因L858R和Del19突变的试剂和试剂盒，由于含有上述的引物组合物，准确性和灵敏度高，成本低。本专利技术提供的检测EGFR基因L858R和Del19突变的方法，由于应用了上述引物组合物，除了具有准确性和灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对；和，用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对；其中，所述第一野生型基因探针如SEQ ID NO.1所示；所述第一突变型基因探针如SEQ ID NO.2所示；所述第一引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述第二野生型基因探针如SEQ ID NO.5所示；所述第二突变型基因探针如SEQ ID NO.6所示；所述第二引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测EGFR基因L858R和Del19突变的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：用于检测L858R的第一野生型基因探针、第一突变型基因探针和第一引物对；和，用于检测Del19的第二野生型基因探针、第二突变型基因探针和第二引物对；其中，所述第一野生型基因探针如SEQIDNO.1所示；所述第一突变型基因探针如SEQIDNO.2所示；所述第一引物对如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述第二野生型基因探针如SEQIDNO.5所示；所述第二突变型基因探针如SEQIDNO.6所示；所述第二引物对如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针均独立地于5’端结合荧光基团，于3’端结合淬灭基团；所述第一野生型基因探针和所述第一突变型基因探针的荧光基团不同；所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的荧光基团不同。3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述第一野生型基因探针、所述第一突变型基因探针、所述第二野生型基因探针和所述第二突变型基因探针的3’端均独立地结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX；优选地，所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ，优选为NFQ。4.根据权利要求1-3任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：段小红，承康平，杨春燕，魏然，丁蕊，王东亮，周启明，
申请(专利权)人：南京求臻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32