一种海洋抗耐药菌活性物质及制备和用途制造技术

本发明专利技术提供一种海洋灰黄青霉，分类命名为Penicillium griseofulvum ZZ380，是从海洋动物粗腿厚纹蟹中分离培养而获得。本发明专利技术利用海洋灰黄青霉发酵制备获得灰黄青霉碱双醚A，所述灰黄青霉碱双醚A具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性，可显著抑制耐药菌MRSA的生长，在治疗耐药菌MRSA感染方面具有应用前景，可在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中应用。灰黄青霉碱双醚A化学结构式为：

【技术实现步骤摘要】
一种海洋抗耐药菌活性物质及制备和用途
本专利技术属医药领域,涉及从海洋灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)的代谢产物中获得的具有抗菌活性化合物灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)，以及其制备方法和在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。
技术介绍
抗生素滥用引起的致病菌对抗生素的耐药性不断增强,耐药突变菌株的种类和数量不断增多已成为威胁人类健康的一个重大难题。在金黄色葡萄球菌感染的病例中,被称为超级细菌的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)感染所占比例已高达60％,其中30％的病例对万古霉素产生了耐药性并且呈逐年上升的趋势。一直以来万古霉素是治疗MRSA感染的金标药物,然而由于这一金标药物在临床上频繁使用而导致MRSA对其耐药性不断增强。另一方面,微生物出现耐药性变种的速率已经远远超过人类开发新型抗生素的速度,如何对抗耐药菌株尤其是MRSA已成为世界性难题。海洋特殊的物理化学环境以及生物多样性和复杂性,迫使海洋微生物具有与陆地微生物不同的新陈代谢途径、生存繁殖方式和适应机制，因而产生许多陆地微生物无法产生的化学结构新颖和生物活性独特的代谢产物，是发现新型抗耐药菌株活性物质的重要资源。灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)是从海洋灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)的次生代谢产物中分离得到的一个结构新颖的生物碱类化合物,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长具有好的抑制作用,因此灰黄青霉碱双醚A在制备抗MRSA药物方面具有应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种海洋灰黄青霉，分类命名为PenicilliumgriseofulvumZZ380,已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号:CCTCCNO：2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。本专利技术的第二个目的是提供所述海洋灰黄青霉的提取制备方法，是从海洋动物粗腿厚纹蟹(Pachygrapsuscrassipes)中分离海洋真菌ZZ380的方法，通过以下步骤分离培养而获得：(1)灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)的分离培养取粗腿厚纹蟹(Pachygrapsuscrassipes)在75％的乙醇中浸泡10秒除去表面微生物,然后用无菌水清洗三次后匀浆,离心后取上层液配制成不同浓度的悬浮液。取一定量不同浓度的悬浮液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中,在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中,在室温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(ZZ380)接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。所述的粗腿厚纹蟹(Pachygrapsuscrassipes)是从浙江普陀山海滩的岩石缝中获得；所述悬浮液的浓度为1×10-3～1×10-1(取1mL匀浆后离心所得的上层液体,加入9mL无菌水,配成体积浓度为10-1的样品溶液,并逐倍稀释得到体积浓度为10-2和10-3的样品溶液)；所述的样品悬浮液的取样量为100～300μL；所述培养皿所含的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,PotatoDextroseAgar,杭州微生物试剂有限公司)培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为PDA或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为22～28℃；所述的培养时间为5～15天。(2)灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)的菌种鉴定上述步骤(1)分离培养所获得的菌株ZZ380用目前实验室普遍使用的ITSrDNA序列分析方法鉴定其种类,确定为灰黄青霉，分类命名为PenicilliumgriseofulvumZZ380，已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号:CCTCCNO：2018344，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。本专利技术的第三个目的是提供灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA),其化学结构式为：本专利技术的第四个目的是提供灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)的制备方法，通过以下步骤实现：(1)灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)发酵菌液的制备将灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)的菌株接种到含有一定量的液体培养基的大三角烧瓶中,将含有ZZ380菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后得到菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的液体培养基的大三角烧瓶中,特定温度静置培养一定时间后,得到含有活性物质灰黄青霉碱双醚A的ZZ380培养液。所述的ZZ380菌株为产生抗MRSA活性物质灰黄青霉碱双醚A的海洋灰黄青霉(PenicilliumgriseofulvumZZ380)。所述的菌种培养基为马铃薯-葡萄糖肉汤(PotatoDextroseBroth,PDB,土豆200g,葡萄糖20g,海盐35g,水1L)液体培养基,所述的用量为250mL；所述的液体发酵培养基为BMPM液体培养基(葡萄糖20克,甘油20克,大豆粉10克,棉粕10克,硫酸铵1克,碳酸钙10克,海盐35g)；所述的大三角培养瓶为500mL；所述的培养温度为28℃；所述的培养时间为30天。(2)灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)的提取分离纯化菌株ZZ380的发酵菌液过滤后分成发酵菌丝体和发酵液两部分。菌丝体用甲醇提取得到甲醇提取物,发酵液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物。将甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物合并得到总提取物。总提取物先用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，用甲醇和水的混合溶剂梯度洗脱,并用薄层层析分析,合并含有相同成分的组分，得到6个组分(Frs.1～6)；组分6(Fr.6)再用制备型高效液相色谱(HPLC)仪分离纯化,得到纯化合物灰黄青霉碱双醚A。所述柱层析的ODS用量与上柱的样品量比例是30～50g:1.0g；所述的甲醇和水的混合溶剂梯度为80:20,90:10,100:0，为体积比；所述的高效液相分离条件是:创新通恒CXTH-3000高效液相色谱仪,富士C18CT-30色谱柱(280×30mm,10μm),甲醇和水为流动相(90/10,体积比),检测波长235nm,流速为15.0mL/min。(3)灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)的结构鉴定灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)的结构是根据它的紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振(NMR)光谱、高分辨质谱(HRESIMS)数据、电子圆二色谱(ECD)计算以及单晶X-射线衍射等方法相结合而确定。本专利技术的第五个目的是提供灰黄青霉碱双醚A(PenicipyrrodietherA)在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)药物中的应用。所述的灰黄青霉碱双醚A具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的活性，可显著抑制耐药菌MRSA的生长，在治疗耐药菌MRSA感染方面具有应用前景。本专利技术的有益之处在于，(1)从海洋动物粗腿厚纹蟹中分离到一株海洋灰黄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋灰黄青霉，其分类命名为Penicillium griseofulvum ZZ380，已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号:CCTCC NO：2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一种海洋灰黄青霉，其分类命名为PenicilliumgriseofulvumZZ380，已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号:CCTCCNO：2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。2.根据权利要求1所述的一种海洋灰黄青霉的提取制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)灰黄青霉的分离培养取粗腿厚纹蟹在75％的乙醇中浸泡10秒除去表面微生物,然后用无菌水清洗三次后匀浆，离心后取上层液配制成悬浮液，取不同浓度的悬浮液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养，最后将生长良好的单一菌落接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用；(2)灰黄青霉的菌种鉴定上述步骤(1)分离培养所获得的菌株用目前实验室普遍使用的ITSrDNA序列分析方法鉴定其种类，确定为灰黄青霉，分类命名为PenicilliumgriseofulvumZZ380，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号:CCTCCNO：2018344，保藏日：2018.6.4；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。3.根据权利要求2所述的一种海洋灰黄青霉的提取制备方法，其特征在于，步骤(1)所述悬浮液的浓度为1×10-3～1×10-1，取样量为100～300μL。4.根据权利要求2所述的一种海洋灰黄青霉的提取制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂或其它固体斜面培养基。5.根据权利要求2所述的一种海洋灰黄青霉的提取制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的室温培养温度为22～28℃，所述的培养时间为5～15天。6.根据权利要求2所述的一种海洋灰黄青霉的提取制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的粗腿厚纹蟹是从浙江普陀山海滩的岩石缝中获得。7.一种灰黄青霉碱双醚A，其化...

【专利技术属性】
技术研发人员：张治针，宋腾飞，连晓媛，陈梦宣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33