腐蚀稳定性色谱分析用配体制造技术

本发明专利技术涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，如，基于免疫球蛋白结合蛋白的配体，如，葡萄球菌A蛋白，以及制备和使用所述配体的方法。

【技术实现步骤摘要】
腐蚀稳定性色谱分析用配体本申请是申请日为2009年12月23日的第201510532937.8号专利技术名称为“腐蚀稳定性色谱分析用配体”的中国专利申请的分案申请。相关申请本申请要求申请号为No.61/203,664，申请日为2008年12月24日的美国临时专利申请的优先权，其全部内容在此全部并入本申请。
本专利技术涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，例如，基于免疫球蛋白结合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配体，以及包含此类配体的色谱分析基质。
技术介绍
在亲和色谱分析中使用的配体通常赋予对靶分子的高选择性，因此导致了对靶分子的高收率以及快速而经济的纯化。基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂以及色谱分析基质达到了在捕获和纯化抗体的亲和色谱分析中的广泛应用，并且由于其结合IgG而对免疫球蛋白和抗体的亲和性没有显著影响的能力，其同样广泛应用于抗体检测方法。据此，已经开发了多种包含A蛋白－配体的试剂以及介质，并且在商业上可获得，包括，例如，－vAHighCapacity，vAUltra和UltraPlus(Millipore)及ProteinASepharoseTM，MabSelectTM，MabSelectXtraTM和MabSelect(GEHealthcare)和PorosMabCaptureATM(AppliedBiosystems)。为了维持色谱分析用配体(所述配体包括，如，包含基于SpA的色谱分析用配体的树脂)的选择性和结合能力，需要对配体结合树脂(称作色谱分析基质)进行清洁，并且通常在碱性条件下清洗，如，使用氢氧化钠。举例来说，用于清洗和复原基质的标准过程是一种原位清洗(Cleaning-in-place，CIP)的碱性方案，一般包括使用pH14的1MNaOH对基质进行处理。但是，这种不太温和的处理经常是不期望的，当配体是一种蛋白或是基于蛋白的分子时尤其如此。
技术实现思路
本专利技术提供了具有碱稳定性的基于SpA的色谱分析用配体，例如，其能够耐受重复的原位清洗(CIP)循环。更特别的是，基于本专利技术的配体可以在延长的时间中耐受传统的碱性清洗，这使得所述配体成为引人注目的候选物，特别是对于免疫球蛋白进行低成本高效率且高水平的纯化而言尤为如此。在本专利技术的一个方面，碱稳定性色谱分析用配体包含两个或更多个SpA结构域。例如，在这方面的一些实施方式中，提供了碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在基于该方面的一些实施方式中，所述配体包含三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的B结构域或者三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述三个或更多个B结构域或者三个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在另一些实施方式中，所述配体包含四个或更多个SpAB结构域或者四个或更多个SpAZ结构域，所述四个或更多个B结构域或四个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在其它实施方式中，所述配体包含五个或更多个SpAB结构域或五个或更多个SpAZ结构域；或包含六个或更多个SpAB结构域或六个或更多个SpAZ结构域；或包含七个或更多个SpAB结构域或七个或更多个SpAZ结构域，所述五个或更多个B结构域或五个或更多个Z结构域，六个或更多个B结构域或六个或更多个Z结构域，七个或更多个B结构域或七个或更多个Z结构域，被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。基于本专利技术的另一方面，碱稳定性色谱分析用配体包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于n+1位的一个或多个突变为除半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸残基。在一些实施方式中，n代表分离的SpA结构域的23位天冬酰胺残基。在分离的SpA结构域的24位具有突变的示例性配体如表1所示，其中n代表天冬酰胺。表1天然氨基酸的单字母代码及其对应的编码每个氨基酸的三字母密码子在表2中列出。一般地，由于密码子的简并性，多于一个三字母密码子可以编码同一个氨基酸。表2本专利技术还包括一种包含基于本专利技术的一个或多个方面的配体的色谱分析基质，该基质偶联在固体支持物上，如，至少一种不溶的载体。另外，此处提供了使用这种配体的方法。因此，提供了从样品中分离一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)的亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供包含一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)的样品；(b)在一种或多种靶分子(如，免疫球蛋白)同基质结合的条件下将样品与基于本专利技术的基质接触；和(c)在适宜的条件下，例如，合适的pH，通过洗脱而回收一种或多种结合的靶分子(如，免疫球蛋白)。在一些实施方式中，在0.5MNaOH中温育5小时后，或10小时后，或15小时后，或25小时后，或30小时后，本专利技术的碱稳定性色谱分析用配体至少保留其95％的结合能力。此处所述的能被多种配体结合的免疫球蛋白包括，如，IgG，IgA和IgM，或包含抗体或抗体任意片段的任何融合蛋白。此处同样提供了编码多种所述配体的核酸分子，以及包含这些核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞为原核细胞。在其它实施方式中，宿主细胞为真核细胞。另外，本专利技术同样包括了包含此处所述的一种或多种配体及其功能性片段和变体的多肽库。在另一个实施方式中，本专利技术提供了核酸分子库，所述核酸分子编码本专利技术的一种或多种配体或编码其功能性片段和变体。在一些实施方式中，本专利技术提供了基于SpA的配体，其与已知的SpA配体相比展示了变化的(上升或者下降的)结合免疫球蛋白的Fab片段的能力，但维持了同免疫球蛋白的Fc片段结合的能力。在一个实施方式中，基于本专利技术的一种基于SpA的配体显示了与野生型的SpA相比下降的结合免疫球蛋白的Fab片段的能力。在一个示例的实施方式中，基于本专利技术的碱稳定性色谱分析用配体进一步包括第29位的甘氨酸被丙氨酸取代。在另一个实施方式中，基于本专利技术的碱稳定性色谱分析用配体还包括第29位的甘氨酸被除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸取代。附图简述图1描述了SpA的野生型(wt)的IgG结合结构域的核酸序列，如SEQIDNO：1－5所示。SEQIDNO：1表示wtE结构域的核酸序列；SEQIDNO：2表示wtD结构域的核酸序列；SEQIDNO：3表示wtA结构域的核酸序列；SEQIDNO：4表示wtB结构域的核酸序列；SEQIDNO：5表示wtC结构域的核酸序列。图2描述了SpAZ结构域的核酸序列，如SEQIDNO：6所示。图3描述了SpA的野生型(wt)的IgG结合结构域(E、D、A、B和C)的氨基酸序列比对。SEQIDNO：7表示wtE结构域的氨基酸序列；SEQIDNO：8表示wtD结构域的氨基酸序列；SEQIDNO：9表示wtA结构域的氨基酸序列；SEQIDNO：10表示wtB结构域的氨基酸序列；SEQIDNO：11表示wtC结构域的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱稳定性亲和色谱分析用配体，所述配体包括通过多点连接附着于固体支持物的葡萄球菌A蛋白(SpA)的两个或更多个C结构域，其中每个C结构域包含在29位用除丙氨酸、苏氨酸或色氨酸外的氨基酸取代甘氨酸，其中所述C结构域包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:5所示的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，并包含在29位甘氨酸的所述取代，且其中所述配体在0.5M NaOH中温育5小时后，保留其至少95％的结合能力。

【技术特征摘要】
2008.12.24 US 61/203,6641.一种碱稳定性亲和色谱分析用配体，所述配体包括通过多点连接附着于固体支持物的葡萄球菌A蛋白(SpA)的两个或更多个C结构域，其中每个C结构域包含在29位用除丙氨酸、苏氨酸或色氨酸外的氨基酸取代甘氨酸，其中所述C结构域包含与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列或者由SEQIDNO:5所示的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，并包含在29位甘氨酸的所述取代，且其中所述配体在0.5MNaOH中温育5小时后，保留其至少95％的结合能力。2.权利要求1的碱稳定性色谱分析用配体，其中将配体在0.5MNaOH中暴露至少5小时后，配体的碱稳定性程度的顺序为七个C结构域(C7)>六个C结构域(C6)>五个C结构域(C5)>四个C结构域(C4)>三个C结构域(C3)。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·卞，N·索伊斯，S·斯佩克特，K·莱文，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：美国,US