基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开一种基于金纳米团簇的人β2‑微球蛋白检测方法及其试剂盒。本发明专利技术以人β2‑微球蛋白为检测对象，将高量子产率金纳米团簇电致化学发光技术和免疫分析技术有机结合，采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，为一种基于金纳米团簇探针的高性能电致化学发光人β2‑微球蛋白检测方法。对人β2‑微球蛋白检测线性范围为0.044µg/L~1.4µg/L，检测限为0.03µg/L。具有快速、准确、灵敏度高、选择性和稳定性好、样品用量少等特点，具有较好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒，属于分析化学及纳米

技术介绍
β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）是一种内源性低分子量血清蛋白质，由淋巴细胞和其他大多数的有核细胞分泌，在免疫应答中起重要作用。临床上多用于诊断淋巴增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤。其水平与肿瘤细胞数量、生长速率、预后及疾病活动性有关。根据β2-MG水平还可用于骨髓瘤患者分期。此外，病人血或尿中的β2-MG浓度与肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒等密切相关，可以为临床诊断提供较早、可靠和灵敏的指标。目前临床上用于检测血清中人β2-微球蛋白含量的免疫分析方法已发展出很多种，如酶联免疫分析法、放射免疫分析法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和时间分辨荧光免疫分析法等。这些方法存在如灵敏度和准确度低、操作过程繁琐、费用较高、检测时间长等不足，极大地限制其在临床诊断中的应用。而电致化学发光或电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）是指通过电极驱动电子转移而激活光电子发射的过程，目前已经广泛使用在相对简单和低成本的检测平台，特别是在免疫测定和传感领域。电致化学发光免疫分析具有灵敏度高、可控性强、分析速度快、易于联用等多方面的优势，在生命分析领域具有广阔的应用前景，极大促进了临床医学诊断的发展，在建立简单、快速、高灵敏的疾病标志物含量检测新方法上具有重要意义。一种具有优良性质的ECL发光体需要能够产生强而稳定的ECL信号和具有适合的与生物分子（即抗体和核酸）或固体表面（即磁珠或电极）结合的生物偶联或官能化位点，同时保持其原始的光物理和电化学活性。因而寻找新型发光体，发展性能优良的电致化学发光体是电致化学发光分析的重要研究方向。由于纳米发光体比表面积大、催化活性高、亲和力强等特性，在发光材料的研发、生物传感器的构建等方面引起了越来越多的关注。在众多的纳米材料中，金纳米团簇（AuNCs）作为一种新型无毒的ECL发光体近几年得到了人们的广泛关注。其具有丰富的氧化还原性质、水溶性好、可调的荧光发射、良好的光稳定性、较高的荧光量子产率、低毒性、高导电性、易于制备等优良特性。尽管有关AuNCs的荧光性能得到广泛研究与应用，但是由于受其ECL强度小、量子产率低、发光机制不清楚等问题的限制，AuNCs在ECL领域的研究还非常少。针对上述问题，本课题组通过纳米尺度调控制得了高量子产率的金纳米团簇探针新方法，并将其应用于细胞释放多巴胺的检测及小分子生物硫醇等生物分子的高灵敏、快速检测。针对临床肿瘤诊断和治疗的迫切需求，设计和制备基于新型功能化金纳米团簇的高量子产率电致化学发光免疫传感器并将其用于肿瘤标志物的检测具有较重要的学术创新性和临床应用价值。本专利技术提供了一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测方法，及基于该方法制备的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体，加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测。所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL0.1mol/LpH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。所述在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mLpH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL、1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4℃反应0.5~2h，洗涤，拍干。所述加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人β2-微球蛋白抗体酶标板的样品反应孔中加入样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干；加入0.1~10μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50μL，37℃温育30min~60min，洗涤，拍干。所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50μL的0.1~1U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10mmol/L2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37℃温育30min~60min。所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，施加一定的扫描电压，工作电极表面产生电致化学发光辐射，光电倍增管高压设置为600~800V，检测电致化学发光辐射信号。所述根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金纳米团簇的人β2‑微球蛋白检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人β2‑微球蛋白抗体，加入人β2‑微球蛋白，再加入生物素标记的人β2‑微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素‑碱性磷酸酶，再加入2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2‑磷酸‑L‑抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人β2‑微球蛋白的检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体，加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4V~-2V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。3.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1V/V的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1V~-0.5V，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干；（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500μL10mmol/L的KMnO4溶液加入到1.25mL0.1mol/LpH6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5mL后超声30min，结束后12000r.p.m离心10min，用水洗3次，重新分散于2.5mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。4.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5mg/mLpH8.5的多巴胺溶液50~100μL，于4℃反应1~5h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4℃孵育8~12h，漂洗；加入50~100μL、1wt%~5wt%的牛血清白蛋白溶液，于4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，彭花萍，黄种南，洪国粦，刘银环，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35