一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法技术

本发明专利技术属于植物保护领域，提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法。本发明专利技术在小麦苗期时对样本进行多重PCR检测，可以同时检测小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌，为小麦根茎部病害的早期诊断和有效防治提供技术支持。该PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点，可应用于田间小麦样本根茎部病害的快速检测，具有较高的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法
本专利技术属于植物保护领域，具体涉及一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法。
技术介绍
小麦是一种重要的粮食作物，在中国的粮食安全和农业现代化发展中都占有重要地位。山东省是中国小麦第二大主产区，种植面积及产量均居全国前列。但是，近年来，小麦根茎部病害的流行，对山东省小麦的品质和产量造成了很大的损失。小麦纹枯病、小麦根腐病和小麦茎基腐病是三种重要的小麦根茎部病害。小麦纹枯病的主要病原是禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）。小麦根腐病的主要病原是麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）。小麦茎基腐病的病原是镰孢属（Fusariumspp.）真菌。这些病害的病原菌能在土壤中长期存活，在小麦苗期时即可侵染为害。一旦条件合适，病症容易扩展导致蔓延成灾。这些病害常常混合发生，早期症状相似，不易区分，防治较为困难。因此，建立快速检测技术对于小麦根茎部病害的防治具有重要的指导意义。分子生物学的发展和PCR技术的诞生为植物病原菌的检测、鉴定和量化提供了新的方法和手段。多重PCR(multiplexPCR)是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，当体系中存在与各引物对特异互补的模板时,就会出现相应的条带。这一概念是Chamberlian于1988年首先提出。多重PCR具有快速、特异、灵敏、低成本等优点，现已被广泛应用于植物病原菌的检测与鉴别。陈思等利用多重PCR技术，在同一体系中对小麦秆锈病、小麦叶锈病和小麦白粉病进行了准确地区分；高士刚等建立了同步检测黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌的多重PCR方法。目前，虽然已经有相关文献报道过这三种病害（小麦纹枯病、小麦根腐病和小麦茎基腐病）的同时检测，但本专利技术所采用的引物都是自主设计的，并利用正交设计的方法建立和优化了检测体系，能同时检测以上三种小麦根茎部病害，具有重要的实践意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，利用多重PCR技术可以在小麦苗期实现快速检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，包括以下步骤：ST1取样，田间取苗期植株；ST2提取基因组DNA，采用改良的CTAB法提取基因组DNA；ST3进行多重PCR反应，添加根据禾谷丝核菌rDNA-ITS、麦根腐平脐蠕孢菌rDNA-ITS、镰孢菌（Fusariumspp.）EF-1α基因序列设计的引物各一对，添加TaqDNA聚合酶、dNTP，进行多重PCR反应，PCR扩增程序为：预变性94℃，5min；94℃变性30s，53.0-63℃时退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min；ST4进行DNA电泳并分析。优选的，步骤ST3所述设计的引物为SEQIDNO.1-SEQIDNO.6。优选的，步骤ST3所述退火30s，温度为55℃。优选的，步骤ST3中WKF-S18/WKR-S8浓度为0.24-0.48µmol/L。优选的，步骤ST3中RBF-S2/RBR-S1浓度为0.16-0.48µmol/L。优选的，步骤ST3中EF-SF9/EF-SR8浓度为0.24-0.40µmol/L。优选的，步骤ST3中TaqDNA聚合酶为1.5-2.5U。优选的，步骤ST3中dNTP浓度为0.15-0.25mmol/L。更优选的，步骤ST3中WKF-S18/WKR-S8为0.36µmol/L，RBF-S2/RBR-S1为0.48µmol/L，EF-SF9/EF-SR8为0.24µmol/L，TaqDNA聚合酶为2.5U,dNTP为0.15mmol/L。更优选的，同时扩增小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌的基因组DNA，获得174、418和600bp的特异条带，三种病菌的检测灵敏度都是100pg。本专利技术的有益效果是：本专利技术设计小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌的特异性引物，建立并采用正交设计的方法优化这三种病害的PCR检测体系，在小麦苗期时对样本进行多重PCR检测，确定病原菌种类，为小麦根茎部病害的早期诊断和有效防治提供技术支持。在优化体系和条件下能够同时得到扩增长度为174、418、600bp3条特异性片段，未扩增出全蚀病菌、链格孢、根霉菌等其它病原菌模板特异性片段，对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌的检测灵敏度都是100pg。该PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点，可应用于田间小麦样本根茎部病害的快速检测，具有较高的实际应用价值。附图说明图1为不同温度下多重PCR扩增结果，其中M为DNAmarkerDL2000，泳道1-8温度依次为：53.0、53.7、54.9、56.8、59.1、61.0、62.2、63.0℃。图2为正交设计多重PCR扩增电泳图，其中M为DNAmarkerDL2000；泳道1—18为表4中正交试验1-18个水平处理。图3为小麦纹枯病菌（A）、蠕孢菌（B）、镰孢菌（C）单一PCR灵敏度检测结果，其中，M：DL2000的marker；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3：10ng；泳道4：1ng；泳道5：100pg；泳道6：10pg；泳道7：1pg；泳道8：100fg；泳道9：10fg。图4为混合DNA多重PCR灵敏度检测结果，其中，M：DL2000的marker；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3：10ng；泳道4：1ng；泳道5：100pg；泳道6：10pg；泳道7：1pg；泳道8：100fg；泳道9：10fg。图5为多重PCR特异性检测结果，其中：M:DNAmarkerDL2000；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3：禾顶囊壳小麦变种；泳道4：链格孢；泳道5：小孢根霉；泳道6:立枯丝核菌；泳道7：大丽花轮枝孢；泳道8：寄生疫霉烟草致病型；泳道9：桃褐腐病菌；泳道10:齐整小核菌。图6为各地区多重PCR检测结果，其中：M:DNAmarkerDL2000；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3-8:德州地区小麦样本；泳道9-14：聊城地区小麦样本；泳道15：青岛地区小麦样本；泳道16：潍坊地区小麦样本;泳道17-20：泰安地区小麦样本。具体实施方式实施例1快速检测三种小麦根茎部病害的方法的建立和验证No.1材料与方法No.1.1材料供试菌株的种名、编号及宿主见表1。所用供试病原真菌均由山东农业大学真菌与真菌资源利用实验室提供。表1供试菌株小麦样本：2018年3月于山东省德州市、泰安市、潍坊市、临沂市以及青岛市采集田间小麦植株。No.1.2方法No.1.2.1基因组DNA的提取病菌基因组DNA及小麦病组织DNA的提取均采用改良的CTAB法。No.1.2.2多重PCR引物组合根据禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）rDNA-ITS、麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）rDNA-ITS以及镰孢菌（Fusariumspp.）EF-1α基因序列，利用Primer5软件设计多对引物，并从中筛选特异性较好的引物，供试引物组合见表2。引物由上海生工合成。表2试验引物No.1.2.3多重PCR反应体系优化No.1.2.3.1退火温度对多重PCR反应的影响选择在5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特征在于，包括以下步骤：ST1 取样，田间取苗期植株；ST2 提取基因组DNA，采用改良的CTAB法提取基因组DNA；ST3 进行多重 PCR 反应，添加根据禾谷丝核菌rDNA‑ITS、麦根腐平脐蠕孢菌rDNA‑ITS、镰孢菌（Fusarium spp.）EF‑1α基因序列设计的引物各一对，添加Taq DNA聚合酶、d NTP，进行多重 PCR 反应，PCR扩增程序为：预变性 94℃，5 min；94℃变性30s，53.0‑63℃时退火30s，72℃延伸 1min，35个循环，72℃延伸 5 min；ST4 进行DNA电泳并分析。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特征在于，包括以下步骤：ST1取样，田间取苗期植株；ST2提取基因组DNA，采用改良的CTAB法提取基因组DNA；ST3进行多重PCR反应，添加根据禾谷丝核菌rDNA-ITS、麦根腐平脐蠕孢菌rDNA-ITS、镰孢菌（Fusariumspp.）EF-1α基因序列设计的引物各一对，添加TaqDNA聚合酶、dNTP，进行多重PCR反应，PCR扩增程序为：预变性94℃，5min；94℃变性30s，53.0-63℃时退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min；ST4进行DNA电泳并分析。2.根据权利要求1所述的一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特征在于，步骤ST3所述设计的引物为SEQIDNO.1-SEQIDNO.6。3.根据权利要求2所述的一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特征在于，步骤ST3所述退火30s，温度为55℃。4.根据权利要求2所述的一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特征在于，步骤ST3中WKF-S18/WKR-S8浓度为0.24-0.48µmol/L。5.根据权利要求2所述的一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：于金凤，孙晓凤，李鹏昌，张德珍，徐娜娜，刘爱新，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37