一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法。将抗菌肽功能化磁性纳米粒子和细菌进行孵育，在外磁场作用下将吸附了细菌的磁性纳米粒子分离出来，得到磁性纳米粒子‑细菌复合物，然后与对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯‑银包金纳米复合物SERS探针共孵育，形成抗菌肽功能化磁性纳米粒子‑细菌‑SERS探针所组成的三明治夹心结构，在外磁场的作用下将该三明治夹心结构分离出来，通过SERS对不同细菌进行检测鉴别。

A Sandwich Sandwich Structure SERS Method for Detecting Pathogens

The invention belongs to the field of biological detection technology, and discloses a sandwich sandwich structure SERS method for detecting pathogenic bacteria. The functional magnetic nanoparticles of antimicrobial peptides and bacteria were incubated, and the magnetic nanoparticles adsorbed bacteria were separated under the external magnetic field. The magnetic nanoparticles and bacteria complex were obtained. Then the antimicrobial peptides were formed by co-incubation with SERS probe of graphene oxide and silver-coated gold nanocomposites modified by p-mercaptophenylboric acid. The sandwich sandwich structure composed of functionalized magnetic nanoparticles, bacteria and SERS probe was separated from the sandwich sandwich structure under the action of external magnetic field, and different bacteria were detected and identified by SERS.

【技术实现步骤摘要】
一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法。
技术介绍
细菌检测是关系公共安全的一个重要领域。传统用于细菌检测的方法有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附(ELSA)等，它们作为灵敏、高效的微生物定量方法被广泛地使用。但是他们存在需要很长的细菌培养时间、特殊的样品前处理、抗干扰能力差等缺点，因此，开发快速、灵敏度高、特异性强的细菌检测方法，具有重要意义。表面增强拉曼光谱(SERS)在细菌检测中具有快速、高效、特异性高等优点，由于不同物质具有其特有的指纹图谱，SERS同时也是很好的定性工具。利用SERS检测细菌的时候，用于特异性抓取细菌的单元是进行细菌有效检测的关键。目前用于抓取细菌的单元包括抗体、适配体、抗生素、苯硼酸等。抗体具有很高的特异性，但是抗体的价格高，稳定性低；适配体的稳定性较高，特异性也高，但是目前筛选到的能用于特异性捕获细菌的适配体种类较少；抗生素的价格低，稳定性高，能特异性吸附细菌，但是抗生素是小分子物质，对细菌的识别位点较少。抗菌肽具有价格低，性质稳定的优点，对细菌也具有特异性吸附能力，相比于抗生素，抗菌肽由于是长链的多肽，抓取细菌时具有更多的识别位点。但如何对抓取的细菌进行分离和鉴别，仍需要设计新的检测策略。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法。本专利技术方法通过抗菌肽功能化磁性纳米粒子和氧化石墨烯-银包金纳米复合物协同组成的三明治夹心结构用于病原菌的鉴别和检测。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，包括如下步骤：(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：将磁性纳米粒子经表面羧基化修饰后与抗菌肽进行缩合反应，得到抗菌肽功能化磁性纳米粒子；(2)对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针的制备：将氧化石墨烯经巯基化修饰后与银包金纳米粒子混合反应，得到氧化石墨烯-银包金纳米复合物，然后与对巯基苯硼酸混合反应，得到对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针；(3)三明治夹心结构SERS检测病原菌：(a)将抗菌肽功能化磁性纳米粒子和细菌进行孵育，在外磁场作用下将吸附了细菌的磁性纳米粒子分离出来，得到磁性纳米粒子-细菌复合物；(b)将步骤(a)的磁性纳米粒子-细菌复合物和对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针共孵育，形成抗菌肽功能化磁性纳米粒子-细菌-SERS探针所组成的三明治夹心结构，在外磁场的作用下将该三明治夹心结构分离出来；(c)将步骤(b)分离得到的三明治夹心结构通过SERS对不同细菌进行检测鉴别。进一步地，步骤(1)中所述磁性纳米粒子是指具有超顺磁的纳米粒子，包括但不限于Fe3O4、MnFe2O4等。进一步地，步骤(1)中所述表面羧基化修饰的方法如下：将磁性纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)混合反应，得到硅烷化磁性纳米粒子，然后与羧基乙基硅烷三醇钠盐混合反应，得到表面羧基化修饰的磁性纳米粒子。进一步地，步骤(1)中所述抗菌肽包括杆菌肽、蛙皮素、多粘菌素E、爪蟾素等具有细菌识别能力的抗菌肽。进一步地，步骤(2)中所述巯基化修饰的方法如下：将氧化石墨烯分散到无水乙醇中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)缩合剂，搅拌混合均匀后加入巯基乙胺反应，得到巯基化氧化石墨烯。进一步地，步骤(2)中所述银包金纳米粒子通过如下方法制备得到：搅拌条件下将HAuCl4加入到沸腾的超纯水中，然后加入柠檬酸钠搅拌反应，得到金纳米粒子的分散液，冷却到室温，然后加入抗坏血酸溶液搅拌混合均匀，滴加AgNO3溶液搅拌反应，得到银包金纳米粒子。进一步地，步骤(2)中所述银包金纳米粒子与氧化石墨烯的质量比为(0.5～15):1。更优选为10:1。本专利技术的检测方法具有如下优点及有益效果：(1)修饰抗菌肽用于捕获细菌，具有价格低，性质稳定，结合位点多的优点；(2)结合了磁性纳米粒子，可用于样品的富集和除杂，达到更高的检测灵敏度；(3)将银包金纳米粒子结合到氧化石墨烯上面，对银包金起到了保护的作用，防止银包金被氧化，氧化石墨烯增加了4-MPBA的吸附量；(4)利用不同种类细菌结合到4-MPBA以后，4-MPBA的拉曼峰发生了特异性变化，对不同种类细菌实现了区分鉴别。附图说明图1是本专利技术实施例中杆菌肽功能化磁性纳米粒子的合成方法及表征：(A)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的合成步骤示意图；(B)磁性Fe3O4NPs的TEM图；(C)硅烷化磁性Fe3O4NPs的TEM图；(D)磁性Fe3O4NPs、硅烷化磁性Fe3O4NPs和杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs的磁滞回线图；(E)磁性Fe3O4NPs(a)、硅烷化磁性Fe3O4NPs(b)、杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs(c)的红外光谱图；(F)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs在光学显微镜下的图；(G)杆菌肽功能化磁性Fe3O4NPs和大肠杆菌孵育，磁分离以后在光学显微镜下的图。图2是本专利技术实施例中4-MPAB-GO-Au@AgSERStags的合成方法及表征：(A)4-MPBA-GO-Au@AgSERStags的合成步骤示意图；(B)从左到右分别是Au@AgNPs、Au@AgNPs和HS-GO混合5min、Au@AgNPs和HS-GO混合10min的外观图；(C～G)不同比例Au@AgNs和HS-GO结合以后的TEM图。图3是本专利技术实施例中氧化石墨烯增强基底稳定性的测试结果图。图4是本专利技术实施例中检测和鉴别三种致病菌(绿脓杆菌大肠杆菌(p.aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，大肠杆菌(E.coil))的流程原理及结果图。图5本专利技术实施例中三明治夹心结构的形成原理及结果图：(A)没有细菌存在时，不能形成三明治夹心结构，SERStags不能被磁分离出来；(B)没有细菌存在时，拉曼显微镜下只能观察到黑色的磁性Fe3O4团聚物；(C)有细菌存在的时候，形成了三明治夹心结构，SERStags被磁分离出来；(D)有细菌存在的时候，拉曼显微镜下观察到右金属光泽的物质出现，因为有SERStags的引入；(E)单纯大肠杆菌的TEM；(F)大肠杆菌形成三明治夹心结构后的TEM。图6本专利技术实施例中SERS鉴别三种不同种类致病菌(a)4-MPBA的SERS图；(b)绿脓杆菌SERS图；(c)金黄色葡萄球菌SERS图；(d)大肠杆菌SERS图；(e)杆菌肽功能化-Fe3O4SERS图。图7本专利技术实施例中结合PCA鉴别三种不同种类致病菌的图谱及PCA结果图：(A)4-MPBA；(B)金黄色葡萄球菌；(C)绿脓杆菌；(D)大肠杆菌；(E)PCA结果。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：(a)磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)的合成：将1.35gFeCl3·6H2O加入到40mL乙二醇中，搅拌，形成均匀的溶液。继续加入1.0g聚乙二醇(数均分子量为10000)和3.6gNaAc·6H2O，搅拌至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：将磁性纳米粒子经表面羧基化修饰后与抗菌肽进行缩合反应，得到抗菌肽功能化磁性纳米粒子；(2)对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯‑银包金纳米复合物SERS探针的制备：将氧化石墨烯经巯基化修饰后与银包金纳米粒子混合反应，得到氧化石墨烯‑银包金纳米复合物，然后与对巯基苯硼酸混合反应，得到对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯‑银包金纳米复合物SERS探针；(3)三明治夹心结构SERS检测病原菌：(a)将抗菌肽功能化磁性纳米粒子和细菌进行孵育，在外磁场作用下将吸附了细菌的磁性纳米粒子分离出来，得到磁性纳米粒子‑细菌复合物；(b)将步骤(a)的磁性纳米粒子‑细菌复合物和对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯‑银包金纳米复合物SERS探针共孵育，形成抗菌肽功能化磁性纳米粒子‑细菌‑SERS探针所组成的三明治夹心结构，在外磁场的作用下将该三明治夹心结构分离出来；(c)将步骤(b)分离得到的三明治夹心结构通过SERS对不同细菌进行检测鉴别。

【技术特征摘要】
1.一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)抗菌肽功能化磁性纳米粒子的制备：将磁性纳米粒子经表面羧基化修饰后与抗菌肽进行缩合反应，得到抗菌肽功能化磁性纳米粒子；(2)对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针的制备：将氧化石墨烯经巯基化修饰后与银包金纳米粒子混合反应，得到氧化石墨烯-银包金纳米复合物，然后与对巯基苯硼酸混合反应，得到对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针；(3)三明治夹心结构SERS检测病原菌：(a)将抗菌肽功能化磁性纳米粒子和细菌进行孵育，在外磁场作用下将吸附了细菌的磁性纳米粒子分离出来，得到磁性纳米粒子-细菌复合物；(b)将步骤(a)的磁性纳米粒子-细菌复合物和对巯基苯硼酸修饰的氧化石墨烯-银包金纳米复合物SERS探针共孵育，形成抗菌肽功能化磁性纳米粒子-细菌-SERS探针所组成的三明治夹心结构，在外磁场的作用下将该三明治夹心结构分离出来；(c)将步骤(b)分离得到的三明治夹心结构通过SERS对不同细菌进行检测鉴别。2.根据权利要求1所述的一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，其特征在于：步骤(1)中所述磁性纳米粒子是指Fe3O4或MnFe2O4。3.根据权利要求1所述的一种三明治夹心结构SERS检测病原菌的方法，其特征在于步骤(1)中所述表面羧...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海波，江正瑾，袁凯松，郭鑫杰，胡紫微，包芷君，简敬一，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44