烟酸核糖苷的微生物生产制造技术

本发明专利技术涉及一种通过调节导致产生烟酸核糖苷的途径来产生烟酸核糖苷的新方法、表达载体和宿主细胞。

Microbial production of nicotinic acid riboside

The present invention relates to a new method, expression vector and host cell for producing nicotinic acid nucleoside by regulating the pathway leading to the production of nicotinic acid nucleoside.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】烟酸核糖苷的微生物生产本专利技术涉及一种通过调节导致产生烟酸核糖苷的途径来产生烟酸核糖苷的新方法、表达载体和宿主细胞。烟酸核糖苷(nicotinicacidriboside，NaR)为维生素B3的吡啶-核苷形式，其用作烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或NAD+的前体。人们认为高剂量的烟酸(NA)能够帮助提高高密度脂蛋白胆固醇，并降低低密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸，但却尚未完全理解其机制。然而，高剂量NA会导致不良的潮红反应。与NA和NR一样，NaR能够在哺乳动物细胞中被转化为NAD+。然而，已阻止了关于NaR对人类和动物营养的潜在益处的研究，这是因为尚未描述产生其的有效且经济的方法。因此，期望识别用于产生烟酸核糖苷(NaR)的新方法。在20世纪90年代首次阐明了细菌中NAD+的生物合成，且显示出该生物合成依赖于未在真核细胞中发现的两种关键的酶活性：FAD依赖型L-天冬氨酸氧化酶(E.coliNadB,EC1.4.3.16)；以及喹啉合酶(E.coliNadA,EC2.5.1.72)。L-天冬氨酸氧化酶催化L-天冬氨酸至亚氨基琥珀酸的氧化，其利用分子氧作为电子受体并产生过氧化氢，其中涉及松散结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子。已知Escherichiacoli中的酶受到下游产物NAD+的抑制，但却已产生反馈抗性突变体。含有铁-硫簇的喹啉合酶随后进行亚氨基琥珀酸与磷酸二羟丙酮的缩合和环化，产生喹啉(quinolate)。这两种酶的组合活性将从1摩尔的天冬氨酸和1摩尔的磷酸二羟丙酮产生1摩尔的喹啉。三种另外的酶活性为NAD+合成的两种经典的从头途径所共有的：喹啉磷酸核糖基转移酶(E.coliNadC,EC2.4.2.19)；烟酸单核苷酸腺苷转移酶(E.coliNadD,EC2.7.7.18)；以及烟酸单核苷酸腺苷转移酶，即NAD+合成酶(E.coliNadE,EC6.3.1.5)。喹啉磷酸核糖基转移酶将磷酸核糖基部分从磷酸核糖焦磷酸转移至喹啉氮并催化中间物的后续脱羧以产生烟酸单核苷酸(NaMN)、焦磷酸盐和二氧化碳。烟酸单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)使用三磷酸腺嘌呤(ATP)来腺苷酸化NaMN，产生烟酸二核苷酸(NaAD)和焦磷酸盐。NAD+生物合成中的最后一步是由NAD+合成酶催化的，其利用氨或谷氨酰胺作为氮供体来将NaAD酰胺化成NAD+，将1摩尔的ATP水解成AMP和焦磷酸盐。除了从头途径之外，还存在多种用于补救NaR、NR、NMN、烟酰胺(Nam)或烟酸(NA)的特征化途径。已经在Saccharomycescerevisiae中操纵这些补救途径以使得能够产生NR(美国专利号8,114,626)。同时缺失S.cerevisiae基因nrk1、urh1和pnp1使细胞外NR增加～10倍，且额外的nrt1缺失导致进一步增加～4倍至4uM。这些基因分别编码NR激酶(E.coliNadR)、嘌呤核苷磷酸化酶(urh1和pnp1，E.coliDeoD)和NR转运(E.colipnuC)的活性。Nad基因的表达通常是通过转录抑制物在细菌中进行共调节的。在E.coli中，nadA、nadB和pncB的转录受到NadR蛋白的抑制，该NadR蛋白也具有有助于补救途径的催化活性。NadR通过在NAD+存在下结合至保守基序来阻断转录。在Bacillussubtilis中，一种名为YrxA的不同蛋白质通过在NA存在下阻断两个背驰转录的操纵子nadB-nadA-nadC和nifS-yrxA来执行类似的作用(Rossolillo,2005,J.Bacteriol.,187(20),7155-7160)。因此，一直期望找到用于增加烟酸的产生的更有效的方式。本专利技术人现已惊奇地发现了一种用于显著增加烟酸核糖苷的产生的新方法以及所创建的用于这种方法中的宿主细胞和表达载体。本专利技术涉及一种能够产生烟酸核糖苷(NaR)的经遗传修饰的细菌，其中细菌包括选自以下所组成的组的至少一种修饰：a)通过抑制nadA、nadB、nadC基因或其组合的转录来阻断或降低具有抑制NAD+生物合成作用的蛋白质的活性；b)添加或增加编码L-天冬氨酸氧化酶、喹啉合酶、喹啉磷酸核糖基转移酶的基因或其组合的转录；以及c)阻断或降低用作烟酸单核苷酸腺苷转移酶的蛋白质的活性；其中，与没有任何该修饰的细菌相比，具有至少一种该修饰的细菌产生了增加量的NaR。可选地，细菌还可以包括选自以下所组成的组的至少一种修饰：d)阻断或降低用作核苷磷酸化酶的蛋白质的活性；e)阻断或降低用作烟酸核糖苷激酶的蛋白质的活性；f)阻断或降低用作烟酸核糖苷转运蛋白的蛋白质的活性；g)阻断或降低用作烟酸磷酸核糖基转移酶的蛋白质的活性；h)添加或增加用作烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的蛋白质的活性；以及i)添加或增加用作烟酸单核苷酸水解酶的蛋白质的活性。在一些实施方式中，NAD+生物合成的负调节物为包含SEQIDNO：1、2或3中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有抑制NAD+生物合成的活性。在一些实施方式中，喹啉合酶是包含SEQIDNO：23、24或25中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将亚氨基琥珀酸和磷酸二羟丙酮转化成喹啉和磷酸盐的活性。在一些实施方式中，L-天冬氨酸氧化酶是包含SEQIDNO：26或27中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有在FAD依赖型反应中将天冬氨酸转化成亚氨基琥珀酸的活性。在一些实施方式中，喹啉磷酸核糖基转移酶是包含SEQIDNO：28、29或30中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将喹啉和磷酸核糖焦磷酸转化成烟酰胺单核苷酸和二氧化碳的活性。在一些实施方式中，烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白是包含SEQIDNO：4、5或6中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸腺嘌呤二核苷酸的烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性。在一些实施方式中，烟酸核糖苷磷酸化酶是包含SEQIDNO：7、8、18或19中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将烟酸核糖苷转化成烟酸和磷酸核糖的核苷裂解活性。在一些实施方式中，烟酸核糖苷转运蛋白是包含SEQIDNO：9、10或11中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有输入烟酸核糖苷的烟酸核糖苷转运活性。在一些实施方式中，烟酸单核苷酸水解酶是包含SEQIDNO：12、13或14中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸核糖苷的烟酸单核苷酸水解酶活性。在一些实施方式中，烟酸磷酸核糖基转移酶是包含SEQIDNO：15、16或17中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将烟酸、5-磷酸-核糖1-二磷酸和三磷酸腺苷转化为烟酸单核苷酸、二磷酸腺苷、二磷酸盐和磷酸盐的烟酸磷酸核糖基转移酶活性。在一些实施方式中，烟酸核糖苷激酶是包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有将烟酸核糖苷转化成烟酸单核苷酸的烟酸核糖苷激酶活性。在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶是包含SEQIDNO：20、21或22中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体，其中该多肽具有将烟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够产生烟酸核糖苷(NaR)的经遗传修饰的细菌，其中所述细菌包括选自以下所组成的组的至少一种修饰：a)通过抑制nadA、nadB、nadC基因或其组合的转录来阻断或降低具有抑制NAD+生物合成作用的蛋白质的活性；b)添加或增加编码L‑天冬氨酸氧化酶、喹啉合酶、喹啉磷酸核糖基转移酶的基因或其组合的转录；以及c)阻断或降低用作烟酸单核苷酸腺苷转移酶的蛋白质的活性；其中，与没有任何所述修饰的所述细菌相比，具有所述至少一种修饰的所述细菌产生增加量的NaR。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 US 62/309,2381.一种能够产生烟酸核糖苷(NaR)的经遗传修饰的细菌，其中所述细菌包括选自以下所组成的组的至少一种修饰：a)通过抑制nadA、nadB、nadC基因或其组合的转录来阻断或降低具有抑制NAD+生物合成作用的蛋白质的活性；b)添加或增加编码L-天冬氨酸氧化酶、喹啉合酶、喹啉磷酸核糖基转移酶的基因或其组合的转录；以及c)阻断或降低用作烟酸单核苷酸腺苷转移酶的蛋白质的活性；其中，与没有任何所述修饰的所述细菌相比，具有所述至少一种修饰的所述细菌产生增加量的NaR。2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌还包括选自以下所组成的组的一种或多种额外的修饰：d)阻断或降低用作烟酸核糖苷磷酸化酶的蛋白质的活性；e)阻断或降低用作烟酸核糖苷激酶的蛋白质的活性；f)阻断或降低用作烟酸核糖苷转运蛋白的蛋白质的活性；g)阻断或降低用作烟酸磷酸核糖基转移酶的蛋白质的活性；h)添加或增加用作烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的蛋白质的活性；以及i)添加或增加用作烟酸单核苷酸水解酶的蛋白质的活性。3.根据权利要求1所述的细菌，其中具有抑制NAD+生物合成作用的所述蛋白质是包含SEQIDNO：1、2或3中的任一个的氨基酸序列的多肽或其变体，其中所述多肽具有抑制NAD+生物合成的活性。4.根据权利要求1所述的细菌，其中所述L-天冬氨酸氧化酶是包含SEQIDNO：26或27中的任一个的氨基酸序列的多肽或其变体，其中所述多肽具有在FAD依赖型反应中将天冬氨酸转化成亚氨基琥珀酸的活性。5.根据权利要求1所述的细菌，其中所述喹啉合酶是包含SEQIDNO：23、24或25中的任一个的氨基酸序列的多肽或其变体，其中所述多肽具有将亚氨基琥珀酸和磷酸二羟丙酮转化成喹啉和磷酸的活性。6.根据权利要求1所述的细菌，其中所述喹啉磷酸核糖基转移酶是包含SEQIDNO：28、29或30中的任一个的氨基酸序列的多肽或所述多肽的变体，其中所述多肽具有将喹啉和磷酸核糖焦磷酸转化成烟酸单核苷酸和二氧化碳的活性。7.根据权利要求1所述的细菌，其中所述烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白是包含SEQIDNO：4、5或6中的任一个的氨基酸序列的多肽或所述多肽的变体，其中所述多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸腺嘌呤二核苷酸的烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性。8.根据权利要求2所述的细菌，其中所述烟酸核糖苷磷酸化酶是包含SEQIDNO：7、8、18或19中的任一个的氨基酸序列的多肽或所述多肽的变体，其中所述多肽具有将烟酸核糖苷转化成烟酸和磷酸核糖的核苷裂解活性。9.根据权利要求2所述的细菌，其中所述烟酸核糖苷激酶是包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚当·劳伦斯，席琳·维亚罗格，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL