冷冻保存组合物以及其使用方法技术

冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。还提供了冷冻保存的方法。

Cryopreservation composition and its use method

The cryopreservation composition comprises a carboxylated polyamino acid and at least one organic amphoteric reagent or polysaccharide. The method of cryopreservation is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冷冻保存组合物以及其使用方法
本揭示內容有关适合生物样本的冷冻保存的组合物，以及特别地，包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣的冷冻保存组合物。使用所述冷冻保存组合物的方法也描述在本文中。
技术介绍
冷冻保存是通过冷却至低于零度的温度来保存生物样本如细胞或整个组织的过程。在如此低的温度，任何生物活力，包括通常会导致细胞死亡的生化反应，通常会被有效地阻止。冷冻保存有许多不同的研究和临床应用。举例来说，频繁的研究需要将细胞或组织样本以某种方式存储一段时间，以便保留其恢复生物活力的潜力，例如在细胞培养样本和杂交瘤(hybridoma)的情况下。另外，临床需要频繁保存和储存细胞，同时保留其潜在的生物活力，例如在自体骨髓移植，脐带血储存和人类配子储存的情况下。然而，传统的冷冻保存技术可能会因冰晶的形成和解冻浓缩溶液的离子强度的增加而受到阻碍，这两者都会对生物样本造成损害。在冷冻保存的情况下维持细胞样本的生物活力的一种技术是使用二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，其功能是增加在冷却过程和随后的加热过程中皆存活的细胞的数量。DMSO通常以5％至15％v/v(体积/体积)(0.74至2.5摩尔)的终浓度使用。据信DMSO至少部分通过破坏冰晶形成过程起作用，从而减少细胞膜的物理破坏。但是，DMSO是有毒的，也可引起各种副作用。例如，接受过已保存在DMSO中的自体细胞移植的患者可能会出现副作用，包括头痛，恶心和皮疹。(Davis，JM等人，Blood，75(3)，1990，第781-786页)。另外，一些细胞受到与DMSO长时间接触的不利影响。在冷冻保存的情况下维持细胞样本的生物活力的另一种技术是使用甘油作为冷冻保护剂。甘油通常以5至20％v/v的终浓度使用。尽管甘油对细胞的毒性通常低于DMSO，但甘油会引起渗透问题，特别是解冻后可影响细胞活力。在冷冻保存情况下保持细胞样本的生物活力的另一种技术是使用聚乙二醇(PEG)。但是，大多数研究表明PEG与DMSO结合时效率最高，因此不能消除与DMSO相关的不良特性。此外，PEG经受超声降解，其副产物对哺乳动物细胞有毒。因此，本领域需要在与冷冻保存相关的冷冻和解冻循环期间保护细胞和组织。
技术实现思路
本揭示內容提供包括羧化聚氨基酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣的冷冻保存组合物。在具体例中，所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。在具体例中，所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶。在具体例中，所述多醣是葡聚醣。在具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物对慢速冷冻保存有用并且包括自约0.1％至约20％v/v(体积/体积)的羧化聚氨基酸以及自约0.1％至约20％w/v(重量/体积)的有机两性试剂。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基以及自约0.1％至约20％w/v的多醣。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约20％v/v的羧化聚氨基酸，自约0.1％至约20％w/v的有机两性试剂，以及自约0.1％至约20％w/v的多醣。在具体例中，本文所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸以及自约1％至约10％w/v的有机两性试剂。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约10％v/v的羧化聚氨基以及自约1％至约10％w/v的多醣。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约0.1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸，自约0.1％至约10％w/v的有机两性试剂，以及自约0.1％至约10％w/v的多醣。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂的比率为约1.1:1至约3:1，在具体例中自约1.3:1至约1.7:1，在具体例中约1.5:1。在具体例中，所述用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣的比率为约1.1:1:1至约3:1:1，在具体例中自约1.3:1:1至约1.7:1:1，在具体例中约1.5:1:1。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括约7.5％或更少v/v的羧化聚氨基酸，自约5％或更少w/v的有机两性试剂，以及约5％或更少w/v的多醣。在具体例中，用于慢速冷冻保存的冷冻保存组合物包括约7.5％或更少v/v的羧化聚赖氨酸，约5％或更少w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及约5％或更少w/v的葡聚醣。也提供将生物样本储存在可保活力的条件下的方法，其包括添加冷冻保存组合物至生物样本，以及在所述生物样本上进行慢速冷冻保存，其中所述冷冻保存组合物包括羧化聚赖氨酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。在具体例中，所述冷冻保存组合物包括自约1％至约10％v/v的羧化聚赖氨酸，其具有大于50％的被封闭的氨基，自约1％至约10％w/v四氢嘧啶，以及自约0％至约10％w/v的葡聚醣。在具体例中，根据本揭示內容的冷冻保存组合物对快速冷冻保存有用并且包括自约25％至约55％v/v的羧化聚氨基酸，自约25％至约55％w/v的有机两性试剂，以及任选自约25％至约55％w/v的多醣。在具体例中，所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。在具体例中，所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶。在具体例中，所述用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物并不包括多醣。在具体例中，所述用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括多醣。在具体例中，所述多醣是葡聚醣。在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括自约30％至约52.5％v/v的羧化聚氨基酸，自约25％至约35％w/v的有机两性试剂，以及任选的自约25％至约35％w/v的多醣。在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂的比率为约1.1:1至约3:1，在具体例中自约1.3:1至约1.7:1，在具体例中约1.5:1。在具体例中，用于快速冷冻保存的冷冻保存组合物包括羧化聚氨基酸与有机两性试剂和多醣的比率为约1.1:1:1至约3:1:1，在具体例中自约1.3:1:1至约1.7:1:1，在具体例中约1.5:1:1。也描述了将生物样本储存在可保活力的条件下的方法，其包括添加冷冻保存组合物至生物样本，以及在所述生物样本上进行快速冷冻保存，其中所述冷冻保存组合物包括羧化聚赖氨酸，以及至少一种有机两性试剂或多醣。在具体例中，所述冷冻保存组合物包括自约25％至约55％v/v的羧化聚赖氨酸，其具有大于50％的被封闭的氨基，自约25％至约35％w/v四氢嘧啶，以及任选自约25％至约35％w/v的葡聚醣。附图说明图1为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中TIG-3-20成纤维细胞的细胞恢复率的条形图。图2为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中TIG-3-20成纤维细胞的细胞活力的条形图。图3为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中通过树突状细胞的酯化钙黄绿素(CalceinAM)的细胞活力的条形图。图4为说明本文所述至少一个具体例的冷冻保存组合物中天然杀伤92(NK-92)细胞的细胞恢复率的条形图。图5a和5b是说明NK-92细胞的细胞活力的条形图。图6a和6b为说明本文所述冷冻保存组合物中NK-92细胞解冻后的增殖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冷冻保存组合物，其包括羧化聚氨基酸、有机两性试剂、以及任选地多醣。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.16 US 62/255,8131.一种冷冻保存组合物，其包括羧化聚氨基酸、有机两性试剂、以及任选地多醣。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸是羧化聚赖氨酸。3.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上大于50％的氨基被封闭。4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚赖氨酸上约50％至约65％的氨基被封闭。5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸的存在量为所述冷冻保存组合物的0.1％至约20％v/v。6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸的存在量为所述冷冻保存组合物的1.0％至约10％v/v。7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述有机两性试剂是选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、以及其组合。8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中有机两性试剂的存在量为所述冷冻保存组合物的约0.1％至约20％w/v。9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中有机两性试剂的存在量为所述冷冻保存组合物的约1.0％至约10％w/v。10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述多醣是葡聚醣。11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述多醣的存在量为所述冷冻保存组合物的约0.1％至约20％w/v。12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述多醣的存在量为所述冷冻保存组合物的约1.0％至约10％w/v。13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述多醣和所述有机两性试剂的相同存在量为自约3.0％w/v至约8％w/v。14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存组合物包含约7.5％或更少v/v的羧化聚氨基酸，自约5％或更少w/v的有机两性试剂，以及约5％或更少w/v的多醣。15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸包含约7.5％或更少v/v的羧化聚赖氨酸，所述有机两性试剂包含约5％或更少w/v的四氢嘧啶和/或羟基四氢嘧啶，以及所述多醣包含约5％或更少w/v的葡聚醣。16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸与所述有机两性试剂存在的比率为自约1.1:1至约3:1。17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述羧化聚氨基酸与所述有机两性试剂存在的比率为约1.3:1至约1.7:1。18.如权利要求2所述的组合物，其中所述有机两性试剂为四氢嘧啶，并且所述多醣是葡聚醣。19.如权利要求1至18中任一项所述的组合物，其进一步包括选自由DMEM、EMEM、X-VIVO、盐水、水、以及其组合所组成群组的溶剂。20.一种冷冻保存生物样本的方法，其包含:获得生物样本；以及将所述生物样本与冷冻保存组合物接触，其中所述冷冻保存组合物包含自约1％至约10％v/v的羧化聚氨基酸，自约1％至约10％w/v的有机两性试剂，以及自约0％至约10％w/v的多醣。21.如权利要求20所述的方法，其中所述冷冻保存组合物包含自约1％至约10％v/v的具有大于50％被封闭的氨基的羧化聚赖氨酸，自约1％至约10％w/v四氢嘧啶以及自约1％至约10％w/v的葡聚醣。22.如权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述羧化聚赖氨酸与所述有机两性试剂和所述多醣存在的比率为自约1.1:1:1至约3:1:1。23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述羧化聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·齐尔贝尔博格，S·马托舍维奇，
申请(专利权)人：阿克伦生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US