一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法，是将是将重组酵母菌加入到含D型氨基酸废水中；所述重组酵母菌含有优化后D‑型氨基酸氧化酶基因，所述优化后D‑型氨基酸氧化酶基因的的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的方法解决了废水中D型氨基酸含量偏高，普通活性污泥处理时间长的问题。经过本方法处理的废水完全达到国家二级水排放标准，并缩短废水处理时间。

【技术实现步骤摘要】
一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法
本专利技术属于废水处理领域，涉及一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法。
技术介绍
D型氨基酸的生产技术主要有化学拆分法、生物拆分法、生物转化法等工艺，上述方法在生产中产生的釜残液，母液，设备清洗水等均含有一定量的D型氨基酸。由于大部分D-型氨基酸是自然界不存在的物质，活性污泥中的微生物缺乏相应的酶来代谢D-型氨基酸，使得此类废水的生物处理存在COD下降缓慢，处理时间长的问题，增加了废水的处理成本。因此，亟需一种减轻D型氨基酸生产企业的环保压力，大幅降低废水的处理费用，提升企业的市场竞争力的生产D型氨基酸所产生废水的处理方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法，将重组酵母菌加入到含D型氨基酸废水中；所述重组酵母菌含有优化后D-型氨基酸氧化酶基因，所述优化后D-型氨基酸氧化酶基因的的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示。本专利技术的优点：本专利技术采用优化了酵母来源的D氨基酸氧化酶基因得到优化后D-型氨基酸氧化酶基因并重组到毕赤酵母中，使重组酵母菌的D氨基酸氧化酶的表达量和活性均有提高，并将其加入到含D型氨基酸废水中，使含有D-型氨基酸废水在曝气池的处理时间从24小时降低到12小时，使处理后废水符合排放标准，节约了废水处理成本。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。pGAPZA来源；购自invitrogen公司。菌株的来源：大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞：购自invitrogen公司。毕赤酵母菌为x-33：购自invitrogen公司。实施例11.人工合成优化后D-型氨基酸氧化酶基因(生工生物工程(上海)有限公司)，该基因的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示。2.设计引物上游引物序列为：5'-GAATTCGCAATGGCACTGGTTGTTGTATTAGGA(SEQIDNO.2)下游引物序列为：5'-CTCGAGTCATTATAATTTTGCTTTGAGTTTACGTAA(SEQIDNO.3)3.扩增优化后D-型氨基酸氧化酶基因反应程序：95℃3min95℃30s60℃30s72℃2min30个循环72℃5min用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。4.用EcoRI和XhoI对本实施例步骤3产物进行酶切，反应体系如下：反应条件为37℃3小时。用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶切产物。5.用EcoRI和XhoI对pGAPZA进行酶切，pGAPZA购自invitrogen公司，反应体系如下：反应条件为37℃3小时。用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶切产物。6.用T4DNA连接酶将本实施例步骤4酶切产物与酶切后的pGAPZA载体连接。反应体系如下：反应条件为4℃16小时，得到目标载体。7.将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，先在液体LB培养基中37℃，300rpm培养1小时后，在50ng/mlZeocin抗性LB固体平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。并将阳性转化子接种于含有50ng/mlZeocin的液体LB培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取质粒DNA。实施例2重组载体的酶切线性化1、用AvrII消化约5-10μg的质粒DNA。2、取少量线性化的质粒，用琼脂糖凝胶电泳来检测质粒线性化是否完全。3、如果载体完全线性化，热激来中止反应。用苯酚/氯仿抽提一次，然后用1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇来沉淀线性化的DNA。4、离心后得到线性化质粒DNA，用体积浓度80％的乙醇水溶液洗涤，在空气中晾干，最后溶解在10μL无菌、去离子水。可立即使用或-20℃保存。实施例3氯化锂转化步骤1取适量的毕赤酵母菌x-33，接种于50mLYPD中，30℃振荡培养过夜，至OD600＝0.8-1.0。2室温下，1500g离心5min，用25mL灭菌水重悬；1500g离心10min。3用1mL100mMLiCl重悬。4把悬浮物转移到1.5mLEP管中。55000g离心5min，沉淀细胞，弃上清。6用400μL100mMLiCl重悬细胞。7取50μL悬浮物至1.5mLEP管中。85000g离心5min，沉淀细胞，弃上清。9依次加入以下试剂。240μL50％PEG36μL1MLiCl25μL2mg/mL单链DNA(2mg/mL变性，鲑鱼精DNA片段，溶于TE(10mMTris-HCl,pH8.0；1.0mMEDTA)中，煮沸1mL单链DNA样品5min，迅速冰浴冷却，并存放在冰浴中待用。)线性化质粒DNA10μg溶于50μL无菌水10剧烈振荡，使沉淀完全混合(约1分钟)。11在30℃恒温培养箱，孵育30min。12在42℃水浴热休克25min。138000rpm离心1min，弃上清。14用1mLYPD重悬细胞，30℃振荡(约200rpm)培养。152h后，取100μL培养物，涂布在含有100μg/mLZeocin的YPD平板上，30℃孵育3天。16挑取单菌落，接种于含有100μg/mLZeocin的YPD液体培养基，培养3天。17将培养物离心破碎后加入到含D-色氨酸200mg/L，D-苯丙氨酸200mg/L，D苯丙氨酸200mg/L浓度共计600mg/L的水溶液中，反应1小时后检测D氨基酸残留，D氨基酸降解率为90％。单菌落为重组酵母菌，所述重组酵母菌含有优化后D-型氨基酸氧化酶基因。实施例4将试验用废水调配为：D-色氨酸200mg/L，D-苯丙氨酸200mg/L，D苯丙氨酸200mg/L,COD1200mg/L,NH3-N150mg/L,pH值5.5，共调配100吨。实施例5一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法，将实施例3得到的重组酵母菌接种于30LYPD液体培养基中培养72小时，得到湿重约为3000g的重组酵母菌，所述重组酵母菌含有优化后D-型氨基酸氧化酶基因，所述优化后D-型氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示。培养液无需分离，直接加入到含有实施例4调配的试验用废水的曝气池中。72小时后取活性污泥涂平板，判断目标酵母菌在活性污泥中是否存在，当确定目标酵母菌在活性污泥中大量存在后，即无需再补加目标酵母发酵液，否则向100m3曝气池中加入30L的目标酵母培养液，直至目标酵母菌在活性污泥中稳定并大量存在。实施例6将废水正常流入曝气池，每小时检测废水指标，在12小时后出水达到国家二级排放标准(COD:100,BOD:30,SS:30,NH3-N:(25-30),总磷:3.0)，废水处理时间降低50％，大幅降低了废水处理的成本。序列表<110>博瑞威生物化工（沧州）有限公司<120>一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1&本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法，其特征是将重组酵母菌加入到含D型氨基酸废水中；所述重组酵母菌含有优化后D‑型氨基酸氧化酶基因，所述优化后D‑型氨基酸氧化酶基因的的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母菌处理含D型氨基酸废水的方法，其特征是将重组酵母菌加入到含D型氨基酸废水中；所述重组酵母菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫博，田方，焦华阳，
申请(专利权)人：博瑞威生物化工沧州有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13