一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法，包括如下步骤：在色谱条件下，分别进行专属性试验、线性关系考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验和加样回收率试验；所述色谱条件为：检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：YMC‑Pack ODS‑A C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)：0.6％乙酸(B)；A：8％‑28％，0‑30min；B：92％‑72％，0‑30min；检测波长：330nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；所述对照品溶液和样品溶液中的各活性组分之间具有相同的比例关系。本发明专利技术的方法采用高效液相色谱与紫外检测法联用，检测了金银花50％甲醇提取液中八种有效成分及其含量；通过方法学考察，表明使用的方法良好，稳定准确，灵敏高效，回收率高。

【技术实现步骤摘要】
一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法
本专利技术属于中药成分检测
更具体地，涉及一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法。
技术介绍
金银花由(1963年版)梁·《名医别录》收录的，是忍冬科植物的干燥花蕾，耐旱耐寒。(1977年版)《中国药典》，选定LonicerajaponicaThunb.，LoniceraconfusaDC.等为金银花的原植物。(2005年版)《中国药典》将金银花分为金银花和山银花等，并收录多种相关忍冬类植物，确定药用金银花的正品是忍冬LonicerajaponicaThunb.。金银花LonicerajaponicaThunb.在中国产量高，分布广，廉价易得，为后续的研究提供了来源保障，目前为止，已检测出金银花包含的主要成分有:有机酸类化合物、三萜皂类化合物、黄酮类化合物、无机元素类等，其药效主要表现在:解热抗炎、抗病原微生物、抗氧化、保肝利胆、提高免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂等。其中黄酮类化合物中包括木犀草苷、丁香油酚、香叶醇、芦丁等；有机酸类化合物包括绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸以及异绿原酸等化合物等成分。金银花中还含有挥发油，例如肉豆蔻酸、苯乙醇、棕榈酸、亚油酸、芳樟醇、香叶醇等和三萜皂类如常春藤皂苷元、齐墩果酸、无患子皂苷、银花皂苷甲[9]；含有无机微量元素共15种如钙、磷、锌、铜、钡、铁、锰等。HPLC(高效液相色谱)法在分析药品、食品中质量检测方面得到广泛应用。HPLC法可有效地控制金银花及其相关制剂质量，为改进金银花中药复合药剂和中成药的质量监测提供方法学的保证。同时，大量研究者优化并改进了检测方法，方传代等建立用反相高效液相色谱法建立了一种同时测定芦丁、槲皮素的质量控制方法。该方法使检测效率提高，结果重现性好，可用于金银花的质量监测。高效液相色谱法是检测金银花及其相关中药复合药剂中有效成分含量的主要分析方法。研究者一般检测单一的化学成分类型较多，而对于同时检测出金银花中多种有效成分的检测方法比较少见。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的一个目的在于提供一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法。该方法可对金银花中8种有效成分进行综合评价并测定各组分含量，为金银花药材的质量鉴定提供依据。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法，包括如下步骤：1)在色谱条件下，将样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，比较两种溶液相邻色谱峰的分离度；若所述分离度大于1.5，则说明样品溶液中的各活性组分之间是可分离的；2)在色谱条件下，将2.5-25μL不同体积的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，以进样量(μg)为横坐标(x)，以各活性组分色谱峰峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线，若各活性组分的R2均大于0.9，则说明样品溶液中的各活性组分在各自范围内线性关系良好；3)在色谱条件下，将10μL的对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明高效液相色谱仪精密度良好；4)在色谱条件下，将10μL的样品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明样品溶液中各活性组分重复性良好；5)在色谱条件下，于0-24h不同时间将10μL的样品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，记录在不同时间点各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分稳定性良好；6)取6份2.5mL的样品溶液，向每份样品溶液中分别加入2.5mL的对照品溶液，得混合液；在色谱条件下，从每份混合液中取10μL溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，计算每份混合液中各活性组分的回收率；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分回收性良好；所述色谱条件如下：检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：YMC-PackODS-AC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)：0.6％(乙酸水溶液的体积分数)乙酸(B)；A：8％-28％，0-30min(流动相冲洗时间)；B：92％-72％，0-30min；检测波长：330nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；其中，A：8％-28％，0-30min(流动相冲洗时间)；B：92％-72％，0-30min；表示在流动相冲洗时间0-30min内，色谱柱中A相和B相体积分数的变化范围分别为A：8％-28％，B：92％-72％。流动相的制备：精密量取6mL乙酸，置1000mL容量瓶中，使用超纯水定容，混匀，过0.22μm有机微孔滤膜，超声排气15min。本专利技术的流动相在进入高效液相色谱之前需要过0.22μm有机微孔滤膜。所述对照品溶液和样品溶液中的各活性组分之间具有相同的比例关系。进一步，所述样品溶液的制备包括如下步骤:1)将粉碎的金银花置于具塞锥形瓶中，然后加入50％的甲醇并称定重量，得浓度为0.02g/mL的混合液；将所述混合液超声处理30-50min，使金银花的活性组分有效的释出；超声处理后用50％的甲醇补足损失的重量，使超声前和超声后混合液的重量相等；2)将超声后的混合液摇匀，并过滤除渣；取滤液过0.22μm的有机滤膜，得金银花50％甲醇溶液。进一步，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：精密称取2.18mg新绿原酸、1.05mg隐绿原酸、4.04mg芦丁、2.42mg木犀草苷、1.53mg异绿原酸B，放入250mL棕色容量瓶中，用50％甲醇溶液定容，溶解，混匀，得第一对照品溶液；精密称取6.16mg绿原酸、0.97mg异绿原酸C和2.86mg异绿原酸A，放入25棕色容量瓶中，加入所述第一对照品溶液，定容，混合，混匀；过0.22μm的有机滤膜，得对照品溶液；其中，对混合照品溶液中各组分的浓度分别为：新绿原酸0.00872μg/μL、绿原酸0.246μg/μL、隐绿原酸0.0042μg/μL、芦丁0.01616μg/μL、木犀草苷0.00968μg/μL、异绿原酸B0.00612μg/μL、异绿原酸A0.1144μg/μL、异绿原酸C0.0388μg/μL。进一步，将金银花中的活性组分完全释出的超声处理所要满足的条件如下：超声功率600w，超声频率40KHZ，超声温度40℃。进一步，该方法可同时检测样品溶液中的八种活性组分；所述活性组分为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。进一步，所述样品溶液中各活性组分之间的分离度大于1.5，各活性组分在各自范围内R2均大于0.9990；在重复性、稳定性、加样回收率和精密度实验中，各活性组分的RSD均小于5％。进一步，为了使对照品溶液、样品溶液和流动相不堵塞高效液相色谱仪的柱子；因此对照品溶液、样品溶液和流动相均需要过0.22μm的有机滤膜。本专利技术的有益效果如下：本专利技术的方法采用高效液相色谱与紫外检测法联用，检测了金银花50％甲醇提取液中八种有效成分及其含量；通过方法学考察，表明使用的方法良好，可以作为同时测定金银花50％甲醇提液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的方法，此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在色谱条件下，将样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，比较两种溶液相邻色谱峰的分离度；若所述分离度大于1.5，则说明样品溶液中的各活性组分之间是可分离的；2)在色谱条件下，将2.5‑25μL不同体积的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，以进样量(μg)为横坐标(x)，以各活性组分色谱峰峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线，若各活性组分的R2均大于0.9，则说明样品溶液中的各活性组分在各自范围内线性关系良好；3)在色谱条件下，将10μL的对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明高效液相色谱仪精密度良好；4)在色谱条件下，将10μL的样品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明样品溶液中各活性组分重复性良好；5)在色谱条件下，于0‑24h不同时间将10μL的样品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，记录在不同时间点各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分稳定性良好；6)取6份2.5mL的样品溶液，向每份样品溶液中分别加入2.5mL的对照品溶液，得混合液；在色谱条件下，从每份混合液中取10μL溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，计算每份混合液中各活性组分的回收率；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分回收性良好；所述色谱条件如下：检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：YMC‑Pack ODS‑A C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)：0.6％乙酸(B)；A：8％‑28％，0‑30min；B：92％‑72％，0‑30min；检测波长：330nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；所述对照品溶液和样品溶液中的各活性组分之间具有相同的比例关系。...

【技术特征摘要】
1.一种采用HPLC法测定金银花活性组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在色谱条件下，将样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，比较两种溶液相邻色谱峰的分离度；若所述分离度大于1.5，则说明样品溶液中的各活性组分之间是可分离的；2)在色谱条件下，将2.5-25μL不同体积的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，以进样量(μg)为横坐标(x)，以各活性组分色谱峰峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线，若各活性组分的R2均大于0.9，则说明样品溶液中的各活性组分在各自范围内线性关系良好；3)在色谱条件下，将10μL的对照品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明高效液相色谱仪精密度良好；4)在色谱条件下，将10μL的样品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样6次，每次记录各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD均小于5％，则说明样品溶液中各活性组分重复性良好；5)在色谱条件下，于0-24h不同时间将10μL的样品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，记录在不同时间点各活性组分的色谱峰峰面积；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分稳定性良好；6)取6份2.5mL的样品溶液，向每份样品溶液中分别加入2.5mL的对照品溶液，得混合液；在色谱条件下，从每份混合液中取10μL溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，计算每份混合液中各活性组分的回收率；若各活性组分的RSD小于5％，则说明样品溶液中各活性组分回收性良好；所述色谱条件如下：检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：YMC-PackODS-AC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)：0.6％乙酸(B)；A：8％-28％，0-30min；B：92％-72％，0-30min；检测波长：330nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；所述对照品溶液和样品溶液中的各活性组分之间具有相同的比例关系。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建舫，贺敦严，朴美憬，崔德凤，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11