基于银纳米簇荧光探针的T4多聚核苷酸激酶活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于银纳米簇荧光探针的T4多聚核苷酸激酶活性检测方法，通过制备无标记的、“turn‑off”型荧光探针，并将其用于检测T4 PNK的活性。具体为准备银纳米簇模板化的DNA链为S1(DNA S1)，含有[3′‑G4(TG4)2TG3]序列的DNA链为S2(DNA S2)，将两条链杂交，在富含G序列的作用下，银纳米簇可产生强烈的红色荧光，T4 PNK能使双链DNA的5‑羟基末端磷酸化，从而产生5‑磷酸基末端，其可迅速被λ核酸外切酶识别并降解，导致两条DNA链分离，荧光信号迅速减弱，产生与T4 PNK浓度成反比的信号。因此，应用本发明专利技术可精确检测T4 PNK活性，根据DNA‑AgNCs荧光信号强度，该方法的检测灵敏度可达到0.01U/mL。

【技术实现步骤摘要】
基于银纳米簇荧光探针的T4多聚核苷酸激酶活性检测方法
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种基于银纳米簇荧光探针的T4多聚核苷酸激酶活性检测方法。
技术介绍
DNA磷酸化在细胞代谢过程中起着重要作用，例如核酸代谢和DNA损伤修复等。T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)最初是从感染了T4噬菌体的大肠杆菌中分离得到的，该酶可将ATP中V位上的磷酸基转移到具有5'一羟基的DNA或RNA分子上，常简称为T4激酶。T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)是一种DNA修复酶，可催化ATP或其他三磷酸核苷酸基团转移至单链DNA、双链DNA或RNA的5’-OH末端。T4多聚核苷酸激酶广泛用于DNA和RNA的5'末端标记，标记时以[y-"P]ATP作为底物，采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必须除去5'端未标记的磷酸基，5'端标记的DNA和RNA可用于核酸的定序分析、部分酶切法绘制限制酶图谱、DNA或RNA的指纹分析、经DNase或甲基化保护的DNA足迹分析(DNA-footprinting)及分子杂交研究等，用于DNA或RNA连接酶作用底物的DNA或RNA分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T4多聚核苷酸激酶活性的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)制备两条DNA链：银纳米簇模板化的DNA S1，和含有[3′‑G4(TG4)2TG3]序列的DNA S2，并将DNA S2溶解在TE缓冲液中。(2)将步骤(1)制得的银纳米簇模板化的DNA S1与溶解在TE缓冲液中的DNA S2混合于杂交缓冲液中，加热至95℃持续50s，然后缓慢冷却至室温并孵育20min，使两条DNA链杂交得杂交DNA，将上述杂交DNA加入Tris‑HCl缓冲液中得反应混合物，此反应混合物在37℃孵育30min后，加热至75℃，10min，灭活λexo活性，得到最终反应液。(3)将步骤(2)制得的最...

【技术特征摘要】
1.一种T4多聚核苷酸激酶活性的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)制备两条DNA链：银纳米簇模板化的DNAS1，和含有[3′-G4(TG4)2TG3]序列的DNAS2，并将DNAS2溶解在TE缓冲液中。(2)将步骤(1)制得的银纳米簇模板化的DNAS1与溶解在TE缓冲液中的DNAS2混合于杂交缓冲液中，加热至95℃持续50s，然后缓慢冷却至室温并孵育20min，使两条DNA链杂交得杂交DNA，将上述杂交DNA加入Tris-HCl缓冲液中得反应混合物，此反应混合物在37℃孵育30min后，加热至75℃，10min，灭活λexo活性，得到最终反应液。(3)将步骤(2)制得的最终反应液用荧光仪检测其荧光强度，即可实现对T4PNK的活性检测。2.如权利要求1所述的检测方法,其中步骤(1)中所述的两种DNA链中的DNAS2和银纳米簇模板化之前的DNAS1分别为：DNAS1:5′-CCCTTAATCCCCTATAATAAATTTTAAATATTATTTATTAAT-3′,DNAS2:5′-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3′。3.如权利要求1所述的检测方法,其中步骤(1)中银纳米簇模板化的DNAS1的具体制备方法为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金龙，张永臣，刘冰雪，许传军，王礼学，
申请(专利权)人：南京市第二医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32