一种细胞去核显微操作针及一种细胞去核的方法技术

本发明专利技术提供了一种细胞去核显微操作针及一种细胞去核的方法，属于细胞核移植技术领域，所述细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心。所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。本发明专利技术所述的细胞去核显微操作针进行卵母细胞的去核，去核时间短、去核率高，操作简单，去核后卵母细胞的存活率高，核移植重构胚的发育率高。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞去核显微操作针及一种细胞去核的方法
本专利技术属于细胞核移植
，尤其涉及一种细胞去核显微操作针及一种细胞去核的方法。
技术介绍
哺乳动物的体细胞核移植，即体细胞克隆是近代生物技术和生命科学领域的一项具有划时代意义的重大突破，它证明了分化的体细胞能恢复其未分化状态，并发育为一个完整的个体。该技术在多种哺乳动物都获得成功，在家畜的遗传改良、乳腺生物反应器的制备和人类治疗性克隆等专利技术都具有广阔的应用前景。在体细胞核移植的程序中，卵母细胞核物质的去除，即去核是影响核移植总效率的重要技术环节之一。卵母细胞去核不完全将导致核移植重构胚中染色体倍数异常，最终胚胎因发育受阻而流产或死亡；另外卵母细胞能否耐受物理去核带来的机械损伤也严重影响着去核率。目前核移植中普遍使用的去核方法是机械去核法，即通过显微操作机械性的去除卵母细胞中的核染色质，主要包括盲吸法、半卵去核法、切割去核法和高速离心去核法等。机械的去核方法都存在较高的技术要求，如果方法选择不当或操作不熟练，可能会对受体细胞质的微结构造成严重伤害；且操作时间较长，进而产生活性氧等有害物质，影响重组胚的发育。在机械去核中，去核针的选取对于去核率、操作时间和去核后卵母细胞的存活率有较大的影响。常用的去核针存在以下缺点：1.均为空心针，针的韧性降低，易折断。2.若针尖较小，在吸取含细胞核的卵胞质时极易堵塞针管，需频繁换阵，去核操作时间加长，效率低；若针尖较粗(为20μm左右)时，吸取的卵胞质较多，导致存在于胞质中的核重编程相关因子的丢失严重，进而重构胚的核重编程不完全和表观遗传遗传，胚胎的正常发育受阻。3.去核针锋利的切口，会破坏卵母细胞的细胞骨架和胞质膜等显微结构，造成卵母细胞的死亡和胚胎的发育停滞。4.使用针尖切口较小的去核针则需要两步操作，如挤压去核法，先将去核针扎入极体附近的透明带和卵胞质间的卵周隙中，在透明带形成切口后移出去核针；再将去核针移到卵母细胞上方，向下轻轻挤出极体及其周围的胞质；点击去核则是透明带切口后，用去核针点击卵母细胞透明带一侧，达到去核目的。挤压法对细胞造成的伤害较小，操作耗时短，整体去核效率较高；而点击法在用去核针直接点击透明带时，去核针尖很容易进入透明带中，造成受体细胞的崩溃，同时也浪费操作时间。若用钝性的针去点击透明带，取得了较好的效果，但操作过程需要换针，耗时长，影响操作速度。总之，现有的去核针去核率低，对卵母细胞有较大的破坏，操作复杂，易断针。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种去核率高、操作简单、对卵母细胞损伤小的细胞去核显微操作针及细胞去核方法。基于上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心；所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。优选的，所述第一针管的长度为40～60μm；所述第一针管的外径为25～30μm。优选的，所述第一针管为实心。优选的，所述第二针管内设置角度为145～155°的弯曲拐点。优选的，所述弯曲拐点设置在距第二针管与第一针管连接点1000～1800μm处。优选的，第二针管内部自所述第二针管与第一针管连接点至所述弯曲拐点部分的外径为25～30μm。优选的，第二针管内部所述弯曲拐点至第二针管与第三针管连接点部分的外径由25～30μm逐渐增大到1mm。优选的，所述第二针管的长度为大于1400μm。优选的，所述第三针管的内径为0.85～0.95mm，所述第三针管的外径为0.98～1.05mm。本专利技术还提供了利用所述细胞去核显微操作针进行细胞去核的方法，包括以下步骤：1)将卵母细胞置于显微操作液中；2)在带有显微操作设备的倒置显微镜下，用固定针吸住所述卵母细胞；3)用所述细胞去核显微操作针拨动卵母细胞，调整卵母细胞中极体的位置于卵母细胞的“12点”位置；4)将细胞去核显微操作针从卵母细胞的“1点”位置扎入透明带下的卵周隙，从“11”点和“12”点之间的位置出来，挑破透明带，同时极体及周围的核物质被挤出透明带，实现去核。与现有技术相比，本专利技术所述的细胞去核显微操作针具有以下优势：本专利技术提供的细胞去核显微操作针包括顺次连接的针尖部分、第一针管和第二针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心。本专利技术提供的细胞去核显微操作针的去核率高达86％以上，现有其它方法在60～75％之间，去核率大大提高。本专利技术提供的细胞去核显微操作针，针尖部分为实心，增加了细胞去核显微操作针的韧性，不易断针。本专利技术提供的细胞去核显微操作针一步即可完成卵母细胞的去核，即透明带切口和挤压一次性完成，且不需要换针，操作时间短，效率高。利用本专利技术所述的细胞去核显微操作针进行细胞去核的方法，去核操作时，细胞去核显微操作针只扎入透明带和卵周隙，对卵母细胞质膜及骨架结构的破坏较小，去核后卵母细胞的存活率高，去核率和核移植重构胚的发育率高。本专利技术所述的细胞去核方法，挤出的包含核物质的细胞质较少，只占卵母细胞质的十分之一左右，胞质中核重编程因子的损失较小，有利于体细胞核的重编程，重构胚的发育率高。附图说明图1为实施例1中细胞去核显微操作针的结构示意图。具体实施方式一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；结构如图1所示，其中1为针尖部分，2为第一针管，3为第二针管，4为弯曲，5为第三针管。所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心。所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。在本专利技术中，所述细胞去核显微操作针，优选为玻璃针，更优选为以毛细玻璃管为原料制成。在本专利技术中，所述细胞去核显微操作针包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm，优选为42～48μm，更优选为45μm；本专利技术中，所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm，优选为3.5～4.5μm。本专利技术中所述针尖尾端与第一针管前端直接相连，所述第一针管优选长度为40～60μm，更优选为45～55μm；所述第一针管的外径优选为25～30μm，更优选为26～29μm。本专利技术中，所述第一针管优选为实心。本专利技术中，所述第一针管的尾端与第二针管的前端直接相连；所述第二针管内设置角度为145～155°的弯曲拐点；优选的，所述弯曲拐点优选的设置在距第二针管与第一针管连接点1000-1800μm处，更优选为1400μm处。本专利技术中，设置所述弯曲的作用是使得针尖和第一针管部分能与卵母细胞的中心在同一个平面，利于去核操作时卵母细胞不会随意移动，提高去核的准确率和效率。本专利技术中第二针管内部自所述第二针管与第一针管连接点至所述弯曲拐点部分的外径为25～30μm；第二针管内部所述弯曲拐点至第二针管与第三针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心；所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。

【技术特征摘要】
1.一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心；所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。2.根据权利要求1所述的细胞去核操作针，其特征在于，所述第一针管的长度为40～60μm；所述第一针管的外径为25～30μm。3.根据权利要求1或2所述的细胞去核操作针，其特征在于，所述第一针管为实心。4.根据权利要求1所述的细胞去核操作针，其特征在于，所述第二针管内设置角度为145～155°的弯曲拐点。5.根据权利要求4所述的细胞去核显微操作针，其特征在于，所述弯曲拐点设置在距第二针管与第一针管连接点1000～1800μm处。6.根据权利要求4或5所述的细胞去核显微操作针，其特征在于，第二针管内部自所述第二针管与第一针管连接点至所述弯曲拐点部分的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫华，崔立欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11