生物活性多肽序列的联合鉴定方法技术

生物活性多肽序列的联合鉴定方法，本发明专利技术涉及一种液相色谱/毛细管电泳串联飞行时间质谱鉴定多肽序列的方法，它要解决现有HPLC‑MS鉴定多肽序列检测方法难以提高多肽检测的数量和种类的问题。联合鉴定方法：一、乳铁蛋白溶解在超纯水中，调节体系pH值至7.0～9.0，加入胰蛋白酶，得到水解产物；二、冷冻干燥获得乳铁蛋白水解肽，加入甲酸水复溶；三、复溶后的水解肽分别采用UPLC‑ESI‑QTOF‑MS和CE‑ESI‑QTOF‑MS进行联合分离及质谱分析；四、从步骤三质谱分析获得的数据中鉴定多肽序列。本发明专利技术采用超高效液相色谱和毛细管电泳两种分离设备串联质谱鉴定乳铁蛋白肽，提高了多肽鉴定的数量与种类。

【技术实现步骤摘要】
生物活性多肽序列的联合鉴定方法
本专利技术涉及一种液相色谱/毛细管电泳串联飞行时间质谱鉴定多肽序列的方法。
技术介绍
乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)隶属于转铁蛋白家族，在哺乳动物的唾液、泪液、粘液、肺外分泌物、白血球和精液中均可鉴定出乳铁蛋白。乳铁蛋白在结构和生物活性方面都有较为广泛的研究。乳铁蛋白是一个左右两叶，四个多肽结构组成的蛋白；它是一个高度糖基化的糖蛋白，其糖基化位点在N端Asn上；和乳铁蛋白结合的金属离子主要是Fe2+、Fe3+。越来越多的证据表明乳铁蛋白具有重要的生物活性，如：抗菌作用、抗病毒作用、抗炎症、抗氧化性、细胞增殖与分化、磷脂代谢调控和免疫调节作用。随着研究发现，乳铁蛋白通过各种蛋白酶水解得到多肽也展现了上述的几种活性。Aurora等人发现DPYKLRP,PYKLRP,YKLRP,GILRP四种乳铁蛋肽具有体外的降血压活性；乳铁蛋白的水解片段乳铁素具有抗链球菌的能力；来自于乳铁蛋白的17-41氨基酸序列的多肽LFcinB，对人类的多种癌细胞具有毒性作用，表明其存在一定的抗癌作用。以上乳铁蛋白肽的多种生物功能引起了许多科学与商业的注意。目前，蛋白和水解的多肽是通过一系列液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS)来鉴定。然后由各种蛋白酶消化肽的MS/MS谱与数据库引擎的蛋白质序列相匹配，常用的有Mascot、SEQUEST和X！Tandem等搜索引擎。HPLC根据固定相与流动相的大小可以分为正相色谱和反相色谱。固定相极性大于流动相成为正相色谱，流动相极性大于固定相成为反相色谱。根据填料的不同可以分为离子色谱、分子排阻色谱、亲和色谱等。采用超高效液相色谱(UPLC)进行反相柱分离是前端系统的可供选择的一种快速、高效的分离方法。该方法是通过等度洗脱，或者增加流动相的有机含量的梯度洗脱，多肽因其疏水性差异而在反相柱中分离开来。毛细管电泳作为较为新型的分离设备，其应用较高效液相而言仍处于有待不断开发阶段。毛细管电泳(CE)的工作原理是，分析物的离子在毛细管的分离泳道中，通过高压直流电场作用下，根据其电泳的不同移动性而分离。毛细管电泳极小的流速使分析化学从微升水平跨越到纳升水平。毛细管电泳的分离类型主要分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等速电泳(CITP)、胶束电动毛细管色谱(CIEF)、亲和毛细管电泳(ACE)等，其中最常用的为CZE。电喷雾离子化(ESI)源是蛋白组学和多肽鉴定应用于HPLC与CE对分析物分离后进行离子化的组件。由于无壳液ESI模块在CE串联质谱中应用的发展，该技术可以去除壳液从而增强了离子化的效率。由于CE极小的分离速率(通常约为20nL/min)使ESI源连接CE的模块接口表现出了杰出的离子化性能，从而极大地降低了离子抑制。充分的离子化对于乳铁蛋白肽这样疏水性的糖基肽的鉴定来说尤为重要。因此CE内部高效分离的特点确保了多肽检测峰型的敏感度和可重复性。除了obitrap轨道阱质谱和其他的离子阱仪器，主要的质谱检测还有四级杆飞行时间质谱Q-TOF，该技术也在各个领域应用了很多年。Q-TOF的一次扫描是在一毫秒内的时间内完成的，在该高频脉冲下可以得到高信噪比的MS和MS/MS谱图。另外TOF技术的基本诉求在于，较高的扫描速率和无空间电荷——这可以限制可用离子在仪器腔体内的捕获。理论上高谱图速率可使TOF充分地利用多数的离子，从而确保最优的敏感度，和最大的m/z比的范围。通过Q-TOF鉴定到的MS/MS谱图进行数据分析而确认多肽序列，再由一系列生物信息学工具对多肽的性质进行表征。分离设备与质谱联用的技术都采用的是HPLC-MS的串联方式，且由于TOF质谱的以上优异的性能，HPLC-Q-TOF-MS/MS串联方式多应用于生物样品的蛋白组学和生物标志物的医学鉴定方面。有研究表明利用高分辨Q-TOF的深度鸟枪法蛋白组学，单独一次运行可以从人宫颈癌细胞Hela中鉴定了超过14万条肽段。近年越来越多肽组学研究被应用到了食品、医药等领域，如食品鉴定、功能活性肽、滋味风味肽等方面都采用了这一手段。Sarah等人采用LC-QTOF-MS联用方法从多种标志性肽中来识别猪肉特异性肽；还有研究采用TOF质谱从食物残渣中来鉴定抗氧化多肽；味觉组学研究也采用LC-QTOF-MS/MS方法从酵母提发酵液中获得了10种滋味浓厚的多肽序列。另一方面，CE-MS串联方法应用于蛋白组学也层出不穷。CZE-MS可以在运行100分钟内，单次分离鉴定超过2300个磷酸化的多肽；CZE-MS对于亲水性小的二肽和三肽，强疏水性的肽和疏水性药物多肽的分离具有很强的优势。由于蛋白组学技术的不断发展，国内外许多研究都将HPLC-MS与CE-MS联用技术同时使用来增加鉴定多肽的数量，进而来研究蛋白质组在生物机体内的蛋白定量的差异变化。然而蛋白组学的液质联用技术无法直接移植到食品组分中蛋白酶解物的多肽鉴定。其原因在于食品的酶解技术与蛋白组学的酶解技术具有一定的差异。在使用酶的种类上，蛋白组学常使用胰蛋白酶Trypsin和胞内蛋白酶Lys-C，Lys-C水解蛋白可以产生数量更多的多肽，而食品组分的酶解选择的种类较为多样化，这也导致产生多肽数量参差不齐；在酶解流程上两者也不尽相同，蛋白组学采用标准化酶解技术，这使得目标蛋白可以被充分、有效的剪切，然而食品组分的酶解因工艺的不同需求也会导致各种蛋白的水解程度各有不同。上述的两种原因也导致了食物蛋白的酶解所产生的多肽，无论从个数和种类上都会使其体系更加复杂多样。因此采用现有的单独一种分离设备串联质谱联用的鉴定技术，无法满足食物蛋白的不完全酶解的需要。综合上述技术分析背景，已有的多肽分离鉴定技术主要采用单一方法，虽然也采用联合使用CE-MS与HPLC-MS质谱来增加鉴定的多肽数量和蛋白的种类，但是该技术还多应用于蛋白组学的研究上。由于食品蛋白酶解工艺的复杂多样性，仍采用单一分析检测技术显然无法满足其复杂体系的鉴定需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是要解决现有HPLC-MS鉴定多肽序列主要存在的以下技术问题：(1)分离原理是通过分析物疏水性的大小，与色谱柱中填料相似性的，极性强的多肽保留时间极短，很容易在质谱检测前端除盐时，被排出至废液而丢失；(2)疏水性差异小的多肽很难在高效液相色谱中有效相互分离；(3)常规的蛋白消化多采用非固定化酶类进行酶解，无法防止酶自身水解和酶失活的酶解效率改变这一现象；(4)单一的检测方法难以提高多肽检测的数量和种类，从而提供一种生物活性多肽序列的联合鉴定方法。本专利技术生物活性多肽序列的联合鉴定方法按以下步骤实现：一、乳铁蛋白肽制备：将乳铁蛋白溶解在超纯水中，使用NH4HCO3调节体系pH值至7.0～9.0，按照胰蛋白酶与乳铁蛋白的质量比为1:20～1:50加入胰蛋白酶T6567(≥10,000BAEE酶活单位，EC3.4.21.4，sigma)，得到消化液，在35～38℃环境下消化1～4h，得到水解产物；二、乳铁蛋白肽上样前处理：对步骤一得到的水解产物进行离心处理，获得上清液，然后冷冻干燥得到乳铁蛋白水解肽，使用质量浓度为0.1％～0.5％甲酸水进行复溶，膜过滤后得到复溶后的水解肽；三、复溶后的水解肽分别采用UPLC-ESI-QTOF-MS和CE-ES本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生物活性多肽序列的联合鉴定方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：一、乳铁蛋白肽制备：将乳铁蛋白溶解在超纯水中，使用NH4HCO3调节体系pH值至7.0～9.0，按照胰蛋白酶与乳铁蛋白的质量比为1:20～1:50加入胰蛋白酶T6567，得到消化液，在35～38℃环境下消化1～4h，得到水解产物；二、乳铁蛋白肽上样前处理：对步骤一得到的水解产物进行离心处理，获得上清液，然后冷冻干燥得到乳铁蛋白水解肽，使用质量浓度为0.1％～0.5％甲酸水进行复溶，膜过滤后得到复溶后的水解肽；三、复溶后的水解肽分别采用UPLC‑ESI‑QTOF‑MS和CE‑ESI‑QTOF‑MS进行联合分离及质谱分析，即UPLC系统与CE分别与ESI连接，ESI与QTOF相串联；所述的UPLC‑ESI‑QTOF‑MS是将UPLC系统与ESI串联并联用QTOF，UPLC分离乳铁蛋白肽：复溶后的水解肽采用UPLC搭载C18柱进行色谱分离多肽，色谱分离采用乙腈有机相梯度洗脱，其中色谱分离的水相A为超纯水，包含0.1％～0.5％FA，色谱分离的有机相B为乙腈，包含0.1％～0.5％FA，色谱流出组分被ESI离子化后进入QTOF进行质谱分析；所述的CE‑ESI‑QTOF‑MS是将CE毛细管电泳装置与ESI串联并联用QTOF，CE分离乳铁蛋白肽：复溶后的水解肽采用毛细管电泳分离多肽，电泳流出组分被ESI离子化后进入QTOF进行质谱分析；四、从步骤三质谱分析获得的数据中鉴定多肽序列。...

【技术特征摘要】
1.生物活性多肽序列的联合鉴定方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：一、乳铁蛋白肽制备：将乳铁蛋白溶解在超纯水中，使用NH4HCO3调节体系pH值至7.0～9.0，按照胰蛋白酶与乳铁蛋白的质量比为1:20～1:50加入胰蛋白酶T6567，得到消化液，在35～38℃环境下消化1～4h，得到水解产物；二、乳铁蛋白肽上样前处理：对步骤一得到的水解产物进行离心处理，获得上清液，然后冷冻干燥得到乳铁蛋白水解肽，使用质量浓度为0.1％～0.5％甲酸水进行复溶，膜过滤后得到复溶后的水解肽；三、复溶后的水解肽分别采用UPLC-ESI-QTOF-MS和CE-ESI-QTOF-MS进行联合分离及质谱分析，即UPLC系统与CE分别与ESI连接，ESI与QTOF相串联；所述的UPLC-ESI-QTOF-MS是将UPLC系统与ESI串联并联用QTOF，UPLC分离乳铁蛋白肽：复溶后的水解肽采用UPLC搭载C18柱进行色谱分离多肽，色谱分离采用乙腈有机相梯度洗脱，其中色谱分离的水相A为超纯水，包含0.1％～0.5％FA，色谱分离的有机相B为乙腈，包含0.1％～0.5％FA，色谱流出组分被ESI离子化后进入QTOF进行质谱分析；所述的CE-ESI-QTOF-MS是将CE毛细管电泳装置与ESI串联并联用QTOF，CE分离乳铁蛋白肽：复溶后的水解肽采用毛细管电泳分离多肽，电泳流出组分被ESI离子化后进入QTOF进行质谱分析；四、从步骤三质谱分析获得的数据中鉴定多肽序列。2.根据权利要求1所述的生物活性多肽序列的联合鉴定方法，其特征在于步骤二中所述的离心处理是以10000g离心10min。3.根据权利要求1所述的生物活性多肽序列的联合鉴定方法，其特征在于是步骤二中复溶后使用0.22μm水相滤头过滤。4.根据权利要求1所述的生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜明，陈慧，王震宇，樊凤娇，石璞洁，涂茂林，程述震，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21