在伴侣动物中检测炎症标志物和治疗炎性病症的方法技术

本发明专利技术提供了准确检测和测量来自伴侣动物的生物样品中针对特定抗原的内源性抗体(例如内源性IgA)的水平的方法和系统，其可用于诊断伴侣动物例如狗或猫的炎性疾病，包括肠病(IBD)。这类方法和系统通过使用非侵入性手段鉴定来自患者的样品是否与炎性疾病相关，从而方便地提供对指导治疗决定有用的信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在伴侣动物中检测炎症标志物和治疗炎性病症的方法相关申请本申请要求2016年8月10日提交的美国临时申请号62/373,307和2015年11月6日提交的美国临时申请号62/252,266的优先权，这些申请的内容引入本文作为参考。专利
本专利技术一般性涉及炎症和免疫学领域，例如炎性肠病，更具体地涉及用于诊断和与伴侣动物中的其他疾病区分的炎性病症(例如炎性肠病)的血清学方法和特定算法，特别包括检测和测定内源性抗体，以及用于实施这些方法的诊断试剂盒，以及治疗由此诊断的伴侣动物的方法。专利技术背景炎症通常是对损伤或感染的正常、健康的反应，但有时炎症反应是不成比例的或异常的，因此炎症会严重损害正常组织而不是促进愈合，导致慢性疼痛，促成广泛的多种严重疾病，在某些情况下甚至导致死亡。例如，炎性肠病(IBD)是涉及胃肠道炎症的使人衰弱的和进行性的疾病。症状包括腹痛、痉挛、腹泻和出血。所述炎性疾病的一个指征是在炎症局部部位存在炎症细胞，例如嗜中性粒细胞和巨噬细胞。炎症是血管化组织对感染和/或损伤的反应，并且它受到白细胞粘附到血管内皮细胞和它们浸润到周围组织中的影响。可通过需要活组织检查程序和病理学分析的侵入性方法检测这种局部浓度。炎症状态也可以是全身性的，即炎症细胞分泌的多肽在血清中可检测到。炎性肠病(IBD)描述了特发性胃肠病症，其特征在于持续或复发的胃肠(GI)体征和GI炎症的组织学证据，其中没有发现潜在的病因。有效治疗IBD需要将病症与其他不一定涉及慢性炎症的胃肠道疾病区分开来。虽然已经为人类开发了某些诊断试剂，但这些诊断试剂并不总是准确的，并且缺乏准确的诊断试剂对于伴侣动物如狗和猫来说甚至更加严重。炎性肠病通常被兽医鉴定为伴侣动物肠道疾病的最常见原因，但缺乏其流行的准确数据，主要是因为该疾病的诊断具有挑战性。该疾病在很大程度上变化很大，不仅在严重程度上而且在其整个伴侣动物的GI的解剖学分布中变化很大，特别是较低的GI，并且可能最重要的是所涉及的炎症反应的类型。淋巴浆细胞性肠炎(LPE)是伴侣动物中报道的最常见的形式，其次是较不常见的嗜酸细胞性胃肠炎(EGE)和罕见的肉芽肿性肠炎(GE)。狗和猫IBD在临床上或组织学上与人IBD形式几乎没有相似性(Xavier和Podolsky，Nature，448：427-434(2007)；Cerquetella等，WorldJ.Gastroent.，16：1050-1056(2010)。IBD和IBD相关病症可能在其一生中影响相当大部分的伴侣动物，如果不及时治疗，会导致发病率增加，生活质量下降，在某些情况下会导致癌症。及时准确的诊断该病症很可能导致快速和充分的干预，从而显著提高伴侣动物的生活质量。伴侣动物IBD中最常见的临床体征是呕吐和腹泻，但该疾病可呈现更广泛的临床症状，包括但不限于腹痛、食欲改变和体重减轻，腹胀和痉挛，甚至肠胃气胀。所有这些临床症状都是一般性的并且与许多其他潜在病症重叠，使得确定性诊断极其困难。诊断IBD和区分于其他表面相似的病症如肠易激综合征(IBS)、食物敏感性和/或胃肠道感染的困难阻碍了早期和有效的治疗。用于诊断伴侣动物中IBD的当前最佳方法需要使用相对昂贵、耗费劳动且侵入性的临床、放射照相、内窥镜和/或组织学技术。尽管可采用所有这些技术，但仍具有高度的主观性。胃肠活组织检查的组织病理学评估仍然是诊断伴侣动物胃肠道炎症的金标准。然而，活检标本的质量可能不同，病理学家之间可能缺乏一致性，并且受不同条件影响的组织之间的区分可能是困难的，需要显著的干预、成本和时间。术语IBD包括发现炎症的组织学证据但没有明显的潜在原因并且排除了所有其他病因的病例。总体而言，IBD的诊断仍然是排除的过程，因此代表了漫长而昂贵的过程，这也导致伴侣动物不必要的痛苦和发病率。伴侣动物中的炎性肠病(IBD)对兽医提出了重大挑战。最初的症状通常与非IBD的急性或慢性肠病相混淆，特别是对于那些不熟悉该疾病的兽医。因此，IBD仍未得到诊断和治疗。在最坏的情况下，IBD被误诊，并且伴侣动物可能接受不充分的医疗护理，导致发病率增加和相关的伴侣动物所有者的不适。仅有少数免疫学和炎症标志物已经被验证用于伴侣动物。因此，需要对具有慢性炎性疾病(例如IBD)的伴侣动物敏感且特异的标志物。可用于诊断专门针对伴侣动物定制的IBD的快速且减少侵入性的方法将代表兽医学中的重要临床进展并且将促进早期和更适当的治疗干预以治疗患病的伴侣动物。需要一种更有效、更少侵入性的诊断方法，专门为伴侣动物量身定制，以排除炎症相关的IBD(如果它不是潜在病症的话)或发现IBD。本专利技术解决了这些需求并且还提供了相关的优点。专利技术简述本专利技术提供新的炎症标志物和用于检测它们的方法，以有助于在全身性和/或局部基础上(例如在胃肠道中)诊断和监测炎性疾病。在一个实施方案中，本专利技术提供了用于检测从伴侣动物获得的样品中与炎症相关的一种或多种内源性抗体的存在和/或水平的新方法。内源性抗体可包括对蛋白质如钙卫蛋白、β-整联蛋白、乳铁蛋白和C-反应蛋白的自身抗体，和/或还可以包括对多形核白细胞(PMN或粒细胞，包括嗜中性粒细胞)的内源性抗体和/或对胃肠道(gut)里发现的微生物的内源性抗体。例如，已经令人惊奇地发现，伴侣动物当患有炎性病症时，产生对蛋白质如钙卫蛋白、β-整联蛋白、乳铁蛋白和C-反应蛋白的自身抗体，它们已知与炎症相关联。此类自身抗体先前未被发现或表征，并且意外的且与直觉相反的是身体将产生针对其自身抗炎蛋白的抗体，或者此类抗体可用作病理性炎性病症例如IBD的标志物。因此，本专利技术在另一个实施方案中提供了方法，其包括测定对炎症标志物例如钙卫蛋白和β-整联蛋白、乳铁蛋白和/或C-反应蛋白的免疫球蛋白水平，以便全身性地和/或在局部基础上例如在胃肠道中检测炎症。这些炎症相关的自身抗体可以单独用作标志物以鉴定和表征炎性病症，或与已知的或本文描述的抗PMN抗体、抗微生物抗体、钙卫蛋白及其组合联合使用。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于检测从伴侣动物获得的样品中一种或多种炎症相关的自身抗体的存在和/或水平的新方法，其中所述炎症相关的自身抗体是对炎症标志物的内源性抗体，例如选自一种或多种对钙卫蛋白、整联蛋白、乳铁蛋白和C-反应蛋白的自身抗体；例如，其中炎症相关的自身抗体是IgA抗体，例如，其中患者是狗或猫。在犬科动物和猫科动物中IBD的情况下，我们还鉴定了对多形核白细胞(PMN)和胃肠道中发现的微生物的某些新型的内源性抗体。这些内源性抗体可用于诊断IBD并将其与其他胃肠道疾病区分开来。在某些实施方案中，测定对多形核白细胞(PMN)和肠中发现的微生物的内源性抗体与下述测定相结合：测定一种或多种其他炎症标志物，包括直接测定钙卫蛋白水平，并测定对炎症标志物，例如钙卫蛋白和β-整联蛋白、乳铁蛋白和/或C-反应蛋白的自身抗体。在一些实施方案中，本专利技术提供了检测伴侣动物中炎症相关的内源性抗体的新方法，例如通过检测特异性自身抗体并区分来自伴侣动物的样品是否与炎性肠病(IBD)有关来筛选伴侣动物中IBD的存在或不存在。作为非限制性实例，本专利技术可用于使用经验数据和/或统计算法将来自伴侣动物的样品分类为IBD样品。本专利技术还可用于使用经验数据和/或统计算法来区分IB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测从伴侣动物患者获得的样品中与炎症相关的一种或多种内源性抗体的存在和/或水平的方法，其中所述内源性抗体选自以下一种或多种：i)钙卫蛋白的自身抗体，ii)β‑整联蛋白的自身抗体，iii)乳铁蛋白的自身抗体，iv)C‑反应蛋白的自身抗体，v)对多形核白细胞(PMN或粒细胞，包括嗜中性粒细胞)的内源性抗体，和/或vi)对胃肠道中发现的微生物的内源性抗体，所述方法包括使一种或多种抗原与所述样品接触，其中所述一种或多种抗原是目的内源性抗体特异的，并且其中所述一种或多种抗原与基质或可检测标记结合，和检测所述一种或多种与炎症相关的内源性抗体与一种或多种抗原的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.06 US 62/252,266;2016.08.10 US 62/373,3071.用于检测从伴侣动物患者获得的样品中与炎症相关的一种或多种内源性抗体的存在和/或水平的方法，其中所述内源性抗体选自以下一种或多种：i)钙卫蛋白的自身抗体，ii)β-整联蛋白的自身抗体，iii)乳铁蛋白的自身抗体，iv)C-反应蛋白的自身抗体，v)对多形核白细胞(PMN或粒细胞，包括嗜中性粒细胞)的内源性抗体，和/或vi)对胃肠道中发现的微生物的内源性抗体，所述方法包括使一种或多种抗原与所述样品接触，其中所述一种或多种抗原是目的内源性抗体特异的，并且其中所述一种或多种抗原与基质或可检测标记结合，和检测所述一种或多种与炎症相关的内源性抗体与一种或多种抗原的结合。2.权利要求1的方法，进一步包括将所述样品分类为炎症样品或非炎症样品，其中与炎症相关的一种或多种内源性抗体的存在或水平单独地或组合地与炎症的存在相关。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使用标记抗体的步骤，所述标记抗体特异性结合来自患者物种的免疫球蛋白，以检测与抗原结合的、炎症相关的一种或多种内源性抗体。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是狗或猫。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是全血、血清或血浆。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种与炎症相关的内源性抗体是IgA抗体。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其是选自酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫组织化学测定法和免疫荧光测定法的免疫测定法。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗原与一种或多种基质结合，其中所述基质包含一种或多种微孔板，由此希望检测与不同抗原的结合时，所述不同的抗原在不同的微孔板上或在相同微孔板的不同孔中。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗原与一种或多种基质结合，包括以下步骤：a)将一种或多种抗原粘附到它们各自的基质上，b)用蛋白质例如牛血清白蛋白封闭基质的任何未包被表面，c)将抗原暴露于样品以允许形成抗原-抗体复合物，d)将由此形成的抗原-抗体复合物暴露于结合患者物种的免疫球蛋白的标记抗体，e)检测标记抗体与抗原-抗体复合物的结合。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是狗或猫，其中所述炎症是与IBD相关的炎症，并且其中所述一种或多种待检测的内源性抗体包含a)针对来自胃肠道中发现的微生物的抗原的至少一种内源性抗体，选自抗外膜蛋白C(ACA)抗体、抗鞭毛蛋白抗体(AFA)和它们的组合；和b)至少一种自身抗体，选自钙卫蛋白的自身抗体、β-整联蛋白的自身抗体和它们的组合。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种内源性抗体包含至少一种抗体，所述至少一种抗体选自抗PMN抗体、抗酵母抗体、抗微生物抗体和它们的组合。12.权利要求10的方法，其中所述一种或多种内源性抗体包含一种或多种a)抗PMN抗体，选自抗PMN抗体(APMNA)、核周抗PMN抗体(pAPMNA)和它们的组合；b)抗酵母抗体，选自抗酵母免疫球蛋白A(AYA-IgA)、抗酵母免疫球蛋白G(AYA-IgG)、抗酵母免疫球蛋白M(AYA-IgM)和它们的组合；c)抗微生物抗体，选自抗外膜蛋白C(ACA)抗体、抗鞭毛蛋白抗体(AFA)和它们的组合。13.权利要求11的方法，其中所述一种或多种内源性抗体包含抗鞭毛蛋白抗体(AFA)，所述抗鞭毛蛋白抗体结合细菌鞭毛蛋白或其抗原片段上的一个或多个表位，(i)其由下述基因编码，所述基因能够被选自SEQIDNO1、3、5和7中的一个或多个的第一引物和选自SEQIDNO2、4、6和8中的一个或多个的第二引物扩增，或(ii)其包含选自SEQIDNO9－13的序列中的至少10个(例如，至少20个，例如，至少30个)连续氨基酸。14.权利要求11或12的方法，其中所述一种或多种内源性抗体包含抗外膜蛋白C抗体(ACA)，所述抗外膜蛋白C抗体结合细菌外膜蛋白C或其抗原片段上的一个或多个表位，(i)其由能够通过对应于SEQIDNO14和15的引物扩增的基因编码，或(ii)其包含选自SEQIDNO16、17和18的序列中的至少10个(例如，至少20个，例如，至少30个)连续氨基酸。15.权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种内源性抗体选自APMNA、pAPMNA、AYA-IgA、AYA-IgG、ACA或AFA。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种内源性抗体选自一种或多种炎症相关的自身抗体，例如，选自钙卫蛋白的自身抗体、β-整联蛋白的自身抗体、乳铁蛋白的自身抗体和C-反应蛋白的自身抗体中的一种或多种。17.权利要求16的方法，其中炎症相关的自身抗体是钙卫蛋白的自身抗体或β-整联蛋白的自身抗体。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是犬科动物，并且所述一种或多种内源性抗体是(i)针对细菌外膜蛋白(OmpC)的内源性IgA，和(ii)犬科钙卫蛋白的内源性IgA，所述方法包括以下步骤：a)使与基质结合的第一抗原和与基质结合的第二抗原与样品接触，和b)使用针对犬科IgA的标记抗体检测所述一种或多种IgA标志物与所述一种或多种抗原的结合，其中，(a)第一抗原包含一种或多种来自细菌OmpC的抗原性序列；和(b...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·埃斯特鲁奇，G·汉森，
申请(专利权)人：维蒂卡实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US