一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用，属于生物化学分析检测方法技术领域。包括以下步骤：确定检测ATP的最优条件；配制BUIPTP检测底液；绘制测定ATP的标准曲线；样品中ATP含量的分析：称取含有ATP的待测样品，加水溶解或稀释，并加入Tris‑HCl缓冲液；在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到上述溶液中；在最佳波长处测定二级散射光谱强度。利用本发明专利技术所提供的检测方法检测的ATP的浓度，与客观浓度的偏差小于2.5％，本发明专利技术所提出的检测方法具有很高的精准度；在ATP的浓度低至0.75nmol·L

Application of a binuclear uranyl complex in ATP analysis

The invention discloses the application of a binuclear uranyl complex in ATP analysis, belonging to the technical field of biochemical analysis and detection methods. It includes the following steps: determining the optimum conditions for ATP detection; preparing the bottom solution for BUIPTP detection; drawing the standard curve for ATP determination; analysis of ATP content in the sample: weighing the sample containing ATP, adding water to dissolve or dilute, and adding Tris HCl buffer solution; adding the bottom droplets of BUIPTP detection to the above solution under stirring; The intensity of the two stage scattering spectrum is measured at the best wavelength. The deviation between the concentration of ATP detected by the detection method provided by the invention and the objective concentration is less than 2.5%. The detection method provided by the invention has high accuracy; the concentration of ATP is as low as 0.75 nmol.L.

【技术实现步骤摘要】
一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用
本专利技术涉及生物化学分析检测方法
，具体涉及一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用。
技术介绍
三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)是一种高能化合物，是生物体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，能够储存和传递化学能，参与体内蛋白质、脂肪、糖和核酸的代谢。ATP在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可以作为细胞活性的一个重要标志物。ATP也常作为检测微生物污染的一个指标。目前已有的ATP检测方法大抵操作繁琐，耗时长，制备过程复杂，对仪器设备要求高，精度低等缺点。因此，探索新的、灵敏度高的、快速便捷的检测方法对于检测ATP在食品、药品、环境水样中的微生物污染情况等具有十分重要的意义。
技术实现思路
在光谱分析检测方法中，二级散射(second-orderscattering,SOS)是一种新发展起来的分析技术，因其灵敏度高，简单便捷的优点引起人们的关注，已被用于各种目标分析物的检测。与其他分析法相比较，SOS法线性关系好，线性范围宽，是一种新的光谱分析检测方法。我们在研究中发现，在中性条件下，双核铀酰配合物(binuclearuranyl-isophthalaldehyde-tetrapyrrole,BUIPTP)与ATP能形成一种配合物体系，对体系进行光谱性能测试，发现在体系激发波长的二倍处出现一个强峰，激发波长位于283nm处，在最大激发波长处，体系的SOS强度随着ATP的浓度的增加存在着线性关系，可用于痕量分析，且该方法具有较高的灵敏度，检出限为0.75nmol·L-1，其灵敏度较常见的检测ATP的方法要大大的提高。本专利技术研究了双核铀酰配合物(BUIPTP)与ATP的配位反应对二级散射强度的影响，并对反应条件进行一系列的优化，得出的结果让人满意。本专利技术提供一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用，就是创造性地利用双核铀酰配合物用于二级散射方法，以可以解决现有技术中的上述问题。本专利技术提供了一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用，所述双核铀酰配合物为BUIPTP，该应用包括以下步骤：步骤1，确定检测ATP的最优条件：1-1，在比色管中加入已知浓度的ATP溶液得到待测ATP溶液；1-2，配制BUIPTP检测底液；1-3，配制标准品溶液：在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到待测ATP溶液中，得到ATP标准溶液；1-4，用荧光分光光度计测定不同激发波长下ATP标准溶液二级散射光谱强度，确定检测ATP的最佳波长；1-5，配制不同pH的缓冲溶液，将不同pH的缓冲溶液加入ATP标准溶液中，在最佳波长下测定体系二级散射光谱，确定检测ATP的最佳pH；1-6，将ATP标准溶液孵育0-50min，在最佳波长及pH条件下测定二级散射光谱，确定检测ATP的最佳孵育时间；1-7，在最优条件下，检测不同浓度的ATP的二级散射光谱；步骤2，绘制测定ATP的标准曲线：以ATP的浓度为横坐标，以二级散射光强度为纵坐标绘制测定ATP的标准曲线；步骤3，样品中ATP含量的分析：3-1，称取含有ATP的待测样品，加水溶解或稀释，并加入缓冲液以达到最佳pH，得到待测样品溶液；3-2，在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到待测样品溶液中，得到标准品溶液，孵育0-50min；3-3，在最佳波长处测定孵育后的标准品溶液的二级散射光谱强度；3-4，从标准曲线中查找出所述样品中的ATP浓度，并计算出样品中的ATP含量。所述BUIPTP的结构式如下：较佳地，配制BUIPTP检测底液的过程为：准确称取BUIPTP固体，加入二次蒸馏水溶解，转移至容量瓶，定容，摇匀即得。较佳地，步骤1-7中的待测ATP溶液的浓度分别为0,50,100,200,300,400和500nmol·L-1。较佳地，步骤1-4确定的最佳波长为：激发波长283nm、发射波长为566nm，步骤1-5确定的最佳pH为7，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，步骤1-6确定的最佳孵育时间为30min。较佳地，步骤3-2中的孵育时间为30min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：利用本专利技术所提供的检测方法检测的ATP的浓度，与客观浓度的偏差小于2.5％。可证实本专利技术所提出的检测方法具有很高的精准度。利用本专利技术所提供的检测方法检测的ATP的浓度，可在低至0.75nmol·L-1时仍能检出。可证实本专利技术所提出的检测方法具有很低的检出限。利用本专利技术所提供的检测方法检测的ATP的浓度，在2.5-500nmol·L-1范围内具有良好的检测效果。附图说明图1为本专利技术的ATP与BUIPTP反应和检测ATP的过程示意图；图2为BUIPTP与不同浓度的ATP溶液的二级散射光谱图：其中a-g分别表示ATP的浓度为0,50,100,200,300,400,500nmol·L-1；图3为本专利技术的实施例3测定ATP的标准曲线。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术的双核铀酰配合物在ATP分析中的应用的原理如图1所示：BUIPTP与ATP能形成一种配合物体系，对该体系进行光谱性能测试，发现在体系激发波长的二倍处出现一个强峰，激发波长位于283nm处，在最大激发波长处，体系的SOS强度随着ATP的浓度的增加存在着线性关系。本专利技术中的BUIPTP的制备过程如下：(1)于250mL圆底烧瓶加入0.12mol·L-1盐酸100mL，加入60mmol吡咯、5mmol相应的芳醛，磁子搅拌下常温避光反应，对反应体系进行了TLC实时监测。控制合适的反应时间，当TLC监测反应底物芳醛基本完全消耗后，结束反应，用氨水将反应液中和至pH＝8-9，过滤，并用石油醚不断冲洗至滤液无色。将抽滤所得同体少许送HPLC监测其各组成含量，其余固体可以用乙酸乙酯-石油醚重结晶，得到纯的二吡咯甲烷后，减压干燥即得配体。(2)将IPTP(0.3660g，1.0mmol)和六水合硝酸铀酰(0.5020g，1.0mmol)溶解在100mL无水乙醇/水(3:1，V/V)溶液中，将混合物室温下用磁子搅拌10h使其发生螯合反应。将溶剂减压除去，得到的固体用无水乙醇洗涤数次，然后用柱层析进行提纯，所得产物即为纯的BUIPTP。实施例1：检测ATP的最优条件的确定(1)在10mL比色管中加入3mL浓度为500nmol·L-1的ATP溶液。(2)配制BUIPTP检测底液：用分析天平准确称量BUIPTP固体0.7400g，加入二次蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶，加水定容至刻度线，摇匀，即得10μmol·L-1的BUIPTP检测底液。(3)配制标准品溶液：在搅拌下将5mL的10μmol·L-1的BUIPTP检测底液滴加上述步骤(1)的溶液中。1.1最大激发波长的确定用荧光分光光度计在不同激发波长下测定上述标准品溶液的二级散射光谱强度(ISOS)，比较得出最大激发波长为283nm，最大发射波长为566nm。1.2最佳pH的确定配制pH为4～9的一系列缓冲溶液，将不同pH的缓冲溶液加入到含有ATP以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用，其特征在于，所述双核铀酰配合物为BUIPTP，该应用包括以下步骤：步骤1，确定检测ATP的最优条件：1‑1，在比色管中加入已知浓度的ATP溶液得到待测ATP溶液；1‑2，配制BUIPTP检测底液；1‑3，配制标准品溶液：在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到待测ATP溶液中，得到ATP标准溶液；1‑4，用荧光分光光度计测定不同激发波长下ATP标准溶液二级散射光谱强度，确定检测ATP的最佳波长；1‑5，配制不同pH的缓冲溶液，将不同pH的缓冲溶液加入ATP标准溶液中，在最佳波长下测定体系二级散射光谱，确定检测ATP的最佳pH；1‑6，将ATP标准溶液孵育0‑50min，在最佳波长及pH条件下测定二级散射光谱，确定检测ATP的最佳孵育时间；1‑7，在最优条件下，检测不同浓度的ATP的二级散射光谱；步骤2，绘制测定ATP的标准曲线：以ATP的浓度为横坐标，以二级散射光强度为纵坐标绘制测定ATP的标准曲线；步骤3，样品中ATP含量的分析：3‑1，称取含有ATP的待测样品，加水溶解或稀释，并加入缓冲液以达到最佳pH，得到待测样品溶液；3‑2，在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到待测样品溶液中，得到标准品溶液，孵育0‑50min；3‑3，在最佳波长处测定孵育后的标准品溶液的二级散射光谱强度；3‑4，从标准曲线中查找出所述样品中的ATP浓度，并计算出样品中的ATP含量。...

【技术特征摘要】
1.一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用，其特征在于，所述双核铀酰配合物为BUIPTP，该应用包括以下步骤：步骤1，确定检测ATP的最优条件：1-1，在比色管中加入已知浓度的ATP溶液得到待测ATP溶液；1-2，配制BUIPTP检测底液；1-3，配制标准品溶液：在搅拌下将BUIPTP检测底液滴加到待测ATP溶液中，得到ATP标准溶液；1-4，用荧光分光光度计测定不同激发波长下ATP标准溶液二级散射光谱强度，确定检测ATP的最佳波长；1-5，配制不同pH的缓冲溶液，将不同pH的缓冲溶液加入ATP标准溶液中，在最佳波长下测定体系二级散射光谱，确定检测ATP的最佳pH；1-6，将ATP标准溶液孵育0-50min，在最佳波长及pH条件下测定二级散射光谱，确定检测ATP的最佳孵育时间；1-7，在最优条件下，检测不同浓度的ATP的二级散射光谱；步骤2，绘制测定ATP的标准曲线：以ATP的浓度为横坐标，以二级散射光强度为纵坐标绘制测定ATP的标准曲线；步骤3，样品中ATP含量的分析：3-1，称取含有ATP的待测样品，加水溶解或稀释，并加入缓冲液以达到最佳pH，得到待测样品溶液；3-2，在搅拌下将BUIPTP检...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖锡林，许丽，蒋敏，廖力夫，王娇，彭鹏程，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43