一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法技术

本发明专利技术是一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，属于基因工程技术领域，包括如下步骤：首先将待检测样品固定，脱水，包埋制备成组织切片，并配制液相PCR反应体系、通过PCR反应程序，对组织切片中原位固定的靶DNA进行扩增，再将特异性探针与扩增后的组织切片进行原位杂交，最后通过免疫酶标技术在显微镜下对检测结果进行判断，如果出现蓝紫色阳性信号，则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性并可对病毒做到精确定位。其优点是：本发明专利技术结合普通液相PCR方法灵敏度高和原位杂交方法可以实现组织定位的优点，从而达到对牡蛎疱疹病毒的灵敏、特异检测和精确定位。该检测方法可用于贝类各时期养殖过程中的牡蛎疱疹病毒的跟踪检测，具有很高的使用价值。

An indirect in situ hybridization PCR method for detection of oyster herpesvirus

The present invention is an indirect in situ hybridization PCR detection method for Oyster Herpesvirus, which belongs to the field of genetic engineering technology. It includes the following steps: Firstly, the samples to be tested are fixed, dehydrated and embedded to prepare tissue slices, and then a liquid phase PCR reaction system is prepared, and the target DNA in the tissue slices is fixed in situ through a PCR reaction procedure. After amplification, specific probes were hybridized in situ with the amplified tissue slices. Finally, the results were judged under the microscope by immunoenzymatic labeling technology. If blue-purple positive signals appeared, the Oyster Herpesvirus test results of the sample were positive and the virus could be accurately located. The invention has the advantages of high sensitivity of common liquid phase PCR method and in situ hybridization method to realize tissue localization, thereby achieving sensitive, specific detection and accurate localization of Oyster Herpesvirus. The method can be used to detect Oyster Herpesvirus in shellfish culture in different periods, and has high value in use.

【技术实现步骤摘要】
一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种通过间接原位杂交聚合酶链式反应（indirectin-situPCR,IndirectISPCR）检测牡蛎疱疹病毒（Ostreidherpesvirus1,OsHV-1）的方法。
技术介绍
自20世纪90年代初以来，OsHV-1引起包括我国在内的全球13个国家和地区海水养殖双壳贝类的大规模死亡。目前已知受影响的宿主物种包括牡蛎（6种），扇贝（2种），蛤类（2种）和魁蚶在内的11个物种；其中受影响最严重的是我国养殖的栉孔扇贝（Chlamysfarreri）和欧洲养殖的长牡蛎（Crassostreagigas）。建立准确、灵敏和精确定位的检测方法是及早发现病原并采取相应防控措施前提和基础。目前对于OsHV-1的检测，最常用的方法是聚合酶链式反应（PCR）技术；PCR所采用的引物多是基于病毒基因组C区设计的，并被OIE推荐为该病毒普通PCR检测的通用方法，目前被多个国家和地区广泛采用。PCR检测方法具有灵敏度高和特异性强的优点，但由于其取样过程需要破坏组织结构才能提取DNA，因此检测结果中无法得到病原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1）探针制备：以牡蛎疱疹病毒阳性样本DNA为模板，采用C2/C6引物，经PCR 扩增制备探针；引物信息如下：C2：5＇‑ CTCTTTACCATGAAGATACCCACC ‑3＇、C6：5＇‑ GTGCACGGCTTACCATTTTT ‑3＇；所用PCR反应体系为：10×PCR Buffer 10.0µL，MgCl2 6.0µL，10×PCR DIG Labeling Mix 10.0µL，C2 4.0 µL，C64.0 µL，DNA聚合酶1.0µL，DNA模板4.0µL，去离子水61µL，总体系100µL；所用PCR...

【技术特征摘要】
1.一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1）探针制备：以牡蛎疱疹病毒阳性样本DNA为模板，采用C2/C6引物，经PCR扩增制备探针；引物信息如下：C2：5＇-CTCTTTACCATGAAGATACCCACC-3＇、C6：5＇-GTGCACGGCTTACCATTTTT-3＇；所用PCR反应体系为：10×PCRBuffer10.0µL，MgCl26.0µL，10×PCRDIGLabelingMix10.0µL，C24.0µL，C64.0µL，DNA聚合酶1.0µL，DNA模板4.0µL，去离子水61µL，总体系100µL；所用PCR反应程序为：94℃预变性2min，95℃变性45s，55℃退火45s，68℃延伸2min，30个循环，4℃保存；2）消化：使用一定浓度的蛋白酶K对组织石蜡切片进行特定时间的消化；3）间接原位扩增：以预混好的PCR反应体系对组织切片靶DNA进行原位扩增；所用间接原位扩增PCR反应体系为：10×PCRbuffer5.0µL，MgCl24.0µL，dNTP5.0µL，DNA聚合酶1.0µL，C2/C6引物各2.0µL，去离子水31µL，总体积50µL；所用PCR扩增程序为：94℃预变性2min，95℃变性1min，55℃退火1min，68℃延伸2min，20个循环；4）预杂交与杂交：取间接原位扩增后的组织切片进行预杂交与杂交；将扩增后的组织切片加入500µL预杂交液42℃在湿盒内预杂交2h；所述预杂交液包括50%去离子甲酰胺，4×SSC，10%硫酸葡聚糖，10×Denhardt’s，250µg/ml转移核糖核酸；吸取预杂交液加入500µ...

【专利技术属性】
技术研发人员：白昌明，李亚楠，辛鲁生，王崇明，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37