本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法，扩增方法中涉及8对引物，各引物对上下游引物依次如SEQ ID NO.1～16。具体扩增步骤为提取PEDV总RNA，反转成cDNA，用所述8对引物进行扩增反应，将PCR产物连接到克隆载体pTA2 Vector中，转化TOP10感受态细胞，选取阳性克隆，测序鉴定，最后拼接序列，得到ORF1基因组全序列。可以通过该方法扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的ORF1基因，并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的ORF1基因相关研究奠定基础。
Amplification of ORF1 gene sequence of porcine epidemic diarrhea virus *
The invention discloses a method for amplifying the ORF1 gene full sequence of porcine epidemic diarrhea virus. The method involves eight pairs of primers, each of which has upstream and downstream primers such as SEQ ID NO.1-16 in turn. The specific amplification step is to extract the total RNA of PEDV, reverse it to the DNA, amplify with the 8 pairs of primers, connect the PCR products to the cloning vector pTA2 Vector, transform the TOP10 competent cells, select the positive clones, sequencing and identification, and finally splice the sequence to obtain the whole ORF1 genome sequence. The ORF1 gene of porcine epidemic diarrhea virus variant can be amplified by this * * method, and the variation of gene sequence of porcine epidemic diarrhea virus variant during cell culture passage can be captured. It can also be used as a method to detect PEDV in disease materials and lay a foundation for the study of ORF1 gene of PEDV.
【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）是猪流行性腹泻（PED）的病原，为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，是冠状病毒科α冠状病毒属的成员。该病主要发生于寒潮季节，感染仔猪会因水样腹泻，呕吐，脱水，及电解质紊乱而死亡。其发病的严重程度及死亡率与猪的日龄呈负相关。特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100%。基于近年流行野毒株的出现及大流行，传统商品疫苗已经对当前流行野毒株缺乏产生充分的抵抗作用，高死亡率使养猪业经济损失惨重。1971年，PED于英国首次被报道。欧洲的许多国家陆续报道本病的流行暴发。比利时科学家在1976年从暴发PED的腹泻猪只中分离出类冠状病毒CV777。2005年，中国学者分离到一株野毒，命名为LJB/03。2006年，中国学者从仔猪腹湾的类便样品中分离到6株野毒。2006年初，PEDV疫情开始爆发于免疫后猪群。2010年，中国各大省份陆续出现疫情。2010年10月，国内南方的几个省份暴发了大规模的PEDV感染，并且迅速传播到其他地区，尤其是西北地区。2011～2012年，中国各大省份已大规模爆发PEDV疫情。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒ORF1基因的全长，特别是在细胞上培养的不同代次的种毒的ORF1基因基因全序列。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中ORF1基因的序列变化，从而通过基因的遗传变异分析了解其与毒力或者免疫效力的相关性。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增引物组，由8个引物对组成，各引物对上下游引物依次如SEQIDNO.1～16所示。一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法，包括如下步骤，提取猪流行性腹泻病毒样品总RNA，反转成cDNA，分别利用如上所述8个引物对进行PCR扩增反应，分别进行克隆测序，最后拼接序列，得到ORF1基因全序列。该方法扩增的目的片段ORF1全长为20345bp，由包含46个核苷酸重叠序列且长度分别为12,354个核苷酸和8,037个核苷酸的两个大阅读框组成，占据基因组核苷酸数量约2/3。优选地，所述PCR扩增反应的程序为94℃预变性2min；94℃变性10s；退火温度下退火30s；68℃延伸2min；循环35次，72℃终延伸10min；所述退火温度对应为各引物对各自对应的退火温度。优选地，8个引物对分别为引物对ORF1-1、ORF1-2、ORF1-3、ORF1-4、ORF1-5、ORF1-6、ORF1-7、ORF1-8，各引物对上下游引物依次如SEQIDNO.1～SEQIDNO.16所示。优选地，8个引物对的退火温度分别为：引物对ORF1-1、引物对ORF1-6、引物对ORF1-7、引物对ORF1-8、退火温度均为62.5℃。引物对ORF1-2、引物对ORF1-3、引物对ORF1-4、引物对ORF1-5的退火温度均为65℃。优选地，上述方法中，所述克隆测序的具体方法为将扩增产物回收纯化，扩增产物3’末端加碱基A，然后连接至克隆载体pTA2Vector中，转化TOP10感受态细胞，筛选和鉴定重组菌后，进行测序。所述拼接序列的具体方法为：测序结果利用Lasergene7.10生物信息学软件中的Editseq软件进行去除包括引物对在内的外向端序列，全长序列的拼接及同源性分析同时，运用NCBI中GenBank快速比对工具BLAST进行测序结果的验证或比对搜索，完成序列与数据库中的已有序列进行比对分析。上述引物组或/和扩增方法在猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列扩增方面的应用亦在本专利技术保护范围内。本专利技术还提供一种扩增猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列上特定区域的方法，所述方法为根据需要任意组合上述8个引物对进行扩增反应。上述扩增方法在猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列特定区域研究上的应用亦在本专利技术保护范围内。上述扩增方法能获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的ORF1基因。从而捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的ORF1基因相关研究奠定基础。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术特异性设计出一组能够克隆猪流行性腹泻病毒株传代第65代后的ORF3基因全序列。通过本专利技术提供的引物组可以扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的ORF1基因，并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化，也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的ORF1基因相关研究奠定基础。附图说明图1为本专利技术设计的对引物扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；M为DL5000的Marker；泳道1～8分别为：ORF1-1、ORF1-2、ORF1-3、ORF1-4、ORF1-5、ORF1-6、ORF1-7、ORF1-8。图2为ORF1基因在PEDV基因组中的位置。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列扩增方法，包括如下具体步骤：1、引物设计与合成：根据GenBank中公开的的猪流行性腹泻病毒变异株基因的核苷酸序列，设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列，引物序列和每个引物组扩增长度如表1所示。表1为8个引物对的序列和基因的扩增长度2、病毒总RNA的提取：将专利技术人实验室分离得到的流行毒株在细胞上传代至65代的病毒培养液250µL加入750µL的Trizol中，取250µL的PBS于一灭菌离心管中，加入750µLTRIzol，剧烈振荡，室温下作用5分钟。再加200µL氯仿，剧烈振荡，室温下放置5分钟。4℃12,000r/min离心15分钟。将500µL上层水相移到另一新的灭菌微量离心管中，加入500µL异丙醇，轻柔混匀，-20℃放置15分钟。12,000r/min离心15分钟，倾去上清液。加入1,000µL冰预冷的75%乙醇，缓慢颠倒摇匀。4℃12,000r/min离心15分钟。轻轻弃去上清，放置3~5分钟以风干沉淀。加入20µL的RNaseFree双蒸水溶解RNA，于-20℃保存备用。3、病毒cDNA第一链的合成参照东洋纺（上海）生物科技有限公司的改良型高效逆转录酶试剂盒ReverTraAce（TRT-101）的说明书进行，所得到的cDNA置于-20℃保存。4、PCR的扩增运用8个引物对，使用以下反应体系和反应程序进行扩增：所述扩增反应的体系为10µM的上游引物1.0µL、10µM的下游引物1.0µL、I-52×HighFidelityMasterMix12.5µL、ddH2O8.5µL。所述扩增反应的程序为94℃预变性2min；94℃变性1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增引物组，其特征在于，由8个引物对组成，各引物对上下游引物依次如SEQ ID NO.1～16所示。
【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增引物组，其特征在于，由8个引物对组成，各引物对上下游引物依次如SEQIDNO.1～16所示。2.一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤，提取猪流行性腹泻病毒样品总RNA，反转成cDNA，分别利用权利要求1所述8个引物对进行PCR扩增反应，分别进行克隆测序，最后拼接序列，得到ORF1基因全序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，8个引物对分别为引物对ORF1-1、ORF1-2、ORF1-3、ORF1-4、ORF1-5、ORF1-6、ORF1-7、ORF1-8；8个引物对的退火温度分别为：引物对ORF1-1、引物对ORF1-6、引物对ORF1-7、引物对ORF1-8、退火温度均为62.5℃；引物对ORF1-2、引物对ORF1-3、引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭霄峰，莫梅君，邝燕齐，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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