使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种通过使用SSR技术快速鉴别罂粟原植物的方法，该方法包括以下步骤：(1)根据目的基因序列设计特异性的引物；(2)使用设计的引物对罂粟属的植物DNA进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物使用4％琼脂糖电泳；(4)使用花青素染色；(5)根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，有带为罂粟原植物，没有带的物种为该属其他植物。本发明专利技术特点是快速、高效、准确、低成本、操作简便等优势。

Identification of opium poppy using SSR molecular markers

The invention provides a method for rapid identification of the original plant of poppy by using SSR technology. The method comprises the following steps: (1) designing specific primers according to the sequence of the target gene; (2) using the designed primers to amplify the plant DNA of Papaver; (3) using 4% agarose electrophoresis for PCR amplification products; (4) using anthocyanin dyeing. Color; (5) according to the relative position of the amplified product on the gel, there are other plants belonging to the genus Papaver. The invention has the advantages of fast, high efficiency, accuracy, low cost and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法
：本专利技术属于分子生物学DNA分子标记
，具体涉及对罂粟(Papaversomniferum)原植物进行鉴定的SSR标记方法，罂粟SSR分子标记及其对应引物序列的开发与应用。
技术介绍
：罂粟(Papaversomniferum)为罂粟科(Papaveracea)罂粟属(Papaver)植物，是俗称的鸦片、大烟，也是一种民俗药源植物具有极为重要的价值。罂粟含有100多种生物碱，如吗啡、可待因、蒂巴因、那可汀和罂粟碱都是重要的植物生物碱，可作为医药工业上镇痛药、镇咳药和解痉药的重要原料。但是吗啡和可待因具有严重的毒副作用，吸食者会产生耐受性和成瘾性，特别是吗啡乙酰化而成海洛因对吸食者耐受性和成瘾性发展快，毒副作用大，是滥用最广，毒性最强，危害最大的违禁麻醉品之一。罂粟属在我国有7个种：罂粟(Papaversomniferum)、虞美人(P.rhoeas)、黑环罂粟(P.pavoninum)、长荚罂粟(P.dubium)、野罂粟(P.nudicaule)、灰毛罂粟(P.canescens)和长白山罂粟(P.radicatum)。其中虞美人为常见的园艺花卉植物，并不含有吗啡或可待因成分，也无任何有毒因子，不会让人上瘾或依赖。但其形态特征与罂粟较为相似，常常不能通过普通的传统分类来进行分辨，特别是在无花、果实的情况下，对普通的植株更是无法分辨。这就造成了公安机关对于有疑问的植物究竟是保留还是铲除的困惑，无法及时的进行处理，对于及时打击犯罪分子的工作，也常常被一再拖延，对国家和人民造成了不必要的人力和物力的浪费。简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)也称微卫星DNA(MicrosatalliteDNA),是基于特异引物的PCR标记，SSR位点存在于细胞核、叶绿体以及线粒体基因组中，是真核生物基因组中普遍存在的一种重复序列。SSR根据来源不同可分为基因组SSR(GenomicsSSR，gSSR)和表达序列标签SSR(ExpressedSequenceTagSSR,EST-SSR)。基因组SSR标记中，核基因组SSR(nuclearsimplesequencerepeat,nSSR)在亲缘关系分析、品种鉴定、遗传连锁图谱构建和群体遗传分析等方面作为有用的分子工具。SSR的特点在于其重复序列两端大多是保守的单拷贝序列，可以针对该保守序列区设计特异引物，通过PCR扩增，得到片段大小不同的产物，将产物进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳，可将其长度多态性显示出来。SSR与其他常用的分子标记相比，其优点在：来源于基因组的编码区序列，开发简单快捷，成本低，引物开发不需要进行克隆和测序等繁琐步骤，充分利用现有测序数据；所需DNA量少，标记数量多而且突变丰富。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服现有技术存在的上述缺点，本专利技术的目的在于提供一种较为快速、高效、可靠的基于罂粟属植物分子标记，并利用SSR分子标记快速鉴定罂粟(鸦片)的方法，可提高鉴定结果的高效性、简易性、可靠性、准确性及时效性。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，基于植物SSR分子标记对罂粟科罂粟属罂粟进行鉴定，使用罂粟属植物的表达序列标签SSR和核基因组SSR来检测罂粟，并找到罂粟原植物有扩增而该属其他植物没有扩增的序列，使用琼脂糖电泳跑胶，在电泳凝胶成像系统中获得扩增条带，仅罂粟原植物能扩增并得到指定长度的扩增条带。一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，该方法包括以下步骤：(1)根据目的基因序列设计特异性的引物；(2)使用设计的引物对罂粟属的植物DNA进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物使用4％琼脂糖电泳；(4)使用花青素染色；(5)根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，有带为罂粟原植物，没有带的物种为该属其他植物。一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，该方法包括以下步骤：(1)根据目的基因序列设计特异性的如下引物：PSS5F:5’-TCCATCACCCATAAATCTTCAG-3’PSS5R:5’-TGTTGTTGTTGTTGTTGGAAAA-3’PSS20F:5’-AAGTCCACGGTTTTGGAGG-3’PSS20R:5’-GCAACGATTAAAGTTTACTTTGGAG-3’PS70F:5’-CGGGTTACCCATAACATTAAGC-3’PS70R:5’-TGTTTTACGATGAATTTATGAGTTTGA-3’PS120F:5’-TTGTCTGGATACACTCCCACA-3’PS120R:5’-ATATATATTGCTTTCGTCATATTTGG-3’另外为检测DNA活性，加入一对标定核糖体DNA序列引物：atpB209200F:GACCGACCCTGCTCCTGCatpB209200R:TGTCCTGAAGTTCTTTGTAACGTTGT将制得的引物分装在试剂盒中，引物浓度3nmol/L，将引物按以下比例混合A(PSS5:atpB209:PS70)10:3:7；B(PSS20:atpB209:PS120)8:2.5:10；(2)使用设计的引物对罂粟属的植物DNA进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物使用4％琼脂糖电泳；(4)使用花青素染色；(5)根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，有带为罂粟原植物，没有带的物种为该属其他植物。根据所述的一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，SSR的扩增反应体系各组分为：根据所述的一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，PCR扩增程序为：95℃变性4min，1个循环；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s(进行30个循环)；72℃延伸4min，1个循环，最后4℃保持。根据所述的一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，使用4％琼脂糖凝胶电泳使用普通花青素染色。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术通过对中国分布的罂粟属植物进行采样，并采用了多个个体，构建了中国分布的罂粟属植物SSR分子标记数据库，然后通过比较发现罂粟属中罂粟植物SSR分子标记序列特有信息位点长度分别出现在300bp、200bp、100bp有带，而非罂粟植物仅在200bp处有带，进一步获罂粟其特有的SSR引物序列。本专利技术使用SSR分子标记的方法来鉴定中国分布的罂粟属植物中罂粟特有的SSR信息长度位点，通过对PSS5、PSS20、PS70和PS120四个引物进行PCR扩增和跑胶，获得有无扩增条带，直接获得鉴定结果，检测过程快速，结果准确性高，该方法大大有利于缉毒工作的快速、有效鉴定鸦片(罂粟)。附图说明图1为罂粟属植物使用A种混合引物扩增产物和产物跑胶图谱。图2为罂粟属植物使用B种混合引物扩增产物和产物跑胶图谱。具体实施方式下面结合附图，用本专利技术的实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此来限定本专利技术。实施例1本专利技术通过对中国分布的罂粟属植物广泛取样，尽可能增加个体数，构建该属植物的SSR分子标记数据库，通过比较发现罂粟(鸦片)的SSR分子标记特有信息长度位点，进一步获得其特有的SSR分子标记序列。本专利技术基于植物SSR分子标记对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，我们使用EST-SSR设计长度为300bp左右本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，基于植物SSR分子标记对罂粟科罂粟属罂粟进行鉴定，使用罂粟属植物的表达序列标签SSR和核基因组SSR来检测罂粟，并找到罂粟原植物有扩增而该属其他植物没有扩增的序列，使用琼脂糖电泳跑胶，在电泳凝胶成像系统中获得扩增条带，仅罂粟原植物能扩增并得到指定长度的扩增条带。

【技术特征摘要】
1.一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，基于植物SSR分子标记对罂粟科罂粟属罂粟进行鉴定，使用罂粟属植物的表达序列标签SSR和核基因组SSR来检测罂粟，并找到罂粟原植物有扩增而该属其他植物没有扩增的序列，使用琼脂糖电泳跑胶，在电泳凝胶成像系统中获得扩增条带，仅罂粟原植物能扩增并得到指定长度的扩增条带。2.一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，该方法包括以下步骤：(1)根据目的基因序列设计特异性的引物；(2)使用设计的引物对罂粟属的植物DNA进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物使用4％琼脂糖电泳；(4)使用花青素染色；(5)根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，有带为罂粟原植物，没有带的物种为该属其他植物。3.一种使用SSR分子标记对罂粟的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)根据目的基因序列设计特异性的如下引物：PSS5F:5’-TCCATCACCCATAAATCTTCAG-3’PSS5R:5’-TGTTGTTGTTGTTGTTGGAAAA-3’PSS20F:5’-AAGTCCACGGTTTTGGAGG-3’PSS20R:5’-GCAACGATTAAAGTTTACTTTGGAG-3’PS70F:5’-CGGGTTACCCATAACATTAAGC-3’PS70R:5’-TGTTTTACGATGAATTTATGAGTTTGA-3’PS120F:5’-TTGTCTGGATACACTCCCACA-3’PS1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志云，杨俊波，伊廷双，蔡杰，张志荣，袁文斌，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53