一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法。产可得然多糖的土壤杆菌发酵液离心收集菌体；将收集的沉淀物溶解于碱溶液中，离心去除不溶性菌体；上清液加氯化钙溶液，离心得到胶体沉淀物；加酸溶液搅拌胶体调节pH至5‑8，离心脱水；胶体用去离子水洗涤2‑4次，离心脱水；所得中性胶体，用95％乙醇浸泡5‑10分钟，离心脱水；最后将所得胶体干燥、粉碎即得到可得然多糖精制品。本发明专利技术提供的方法，碱溶液可回收70％以上，且能够再次使用；同时，由于大量碱液的去除，减少了用于中和反应的酸溶液的使用量，因此，可以较大幅度节约可得然多糖分离提取成本。

A method for isolation and purification of Polysaccharides from microbial fermentation broth

The invention discloses a method for separating and purifying available polysaccharides from microbial fermentation broth. The fermentation broth of Agrobacterium tumefaciens, which produces available polysaccharides, centrifuges and collects bacteria; dissolves the collected sediments in alkali solution and centrifuges to remove insoluble bacteria; the supernatant is added with calcium chloride solution and centrifuges to obtain colloidal sediments; the colloids are stirred with acid solution to adjust the pH to 5_8, and centrifugally dehydrated; and the colloids are washed with deionized water for Heart dehydration; the obtained neutral colloid, soaked in 95% ethanol for 5 to 10 minutes, centrifugal dehydration; finally, the colloid was dried and crushed to obtain the refined product of Kedaran polysaccharide. The method provided by the invention can recover more than 70% of the alkali solution, and can be reused; at the same time, the amount of acid solution used for neutralization reaction is reduced due to the removal of a large amount of alkali solution, so that the cost of separation and extraction of the obtained polysaccharide can be greatly saved.

【技术实现步骤摘要】
一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法
本专利技术属于食品工业生物
，涉及一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法。
技术介绍
Curdlan(中文名称：可得然多糖，又称为可得然胶)是一种以葡萄糖、蔗糖等糖类为原料由土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)等微生物发酵生产的高分子聚合物。它是一种由葡萄糖结构单元以β-1，3-糖苷键连接而成的直链多聚葡萄糖，该类聚葡萄糖具有水不溶的性质。Curdlan具有在加热条件下可快速形成凝胶的性质，经85℃以上温度条件，处理10分钟以上即可形成热不逆的凝胶，因此又被称为热凝胶。美国FDA早在1996年就批准Curdlan作为食品原辅料用于食品工业中。Curdlan是继黄原胶、结冷胶后第3个被FDA批准的微生物大分子胶。我国卫生部2006年第8号公告批准Curdlan作为一种新型的食品添加剂。GB2760-2014版规定Curdlan可以作为稳定剂、凝固剂和增稠剂，用于豆腐、面制品、肉制品、鱼糜等食品中。Curdlan精制品，即经过分离提纯后的多糖，应用于食品加工才会发挥出具有较好的效果。因此，从发酵液中分离提纯Curdlan产品开发的重要一环，也占据总生产成本的重要部分。目前，工业化生产中可得然多糖的后提取工艺是对发酵产物碱溶液处理后，用有机溶剂如乙醇沉淀，干燥、粉碎得到Curdlan精制品。该工艺方法存在有机溶剂使用量大，成本高，且存在安全隐患的技术缺陷。专利《一种微生物多糖-热凝胶的分离提取工艺》(公开号：CN1583801A)公开了一种碱溶酸沉的Curdlan提纯工艺。该方法是通过发酵产物碱溶液处理，去除菌体，加酸得到中和凝胶，然后乙醇脱水、烘干、粉碎得到可得然多糖精制品。专利《可得然胶的后提取方法》(公开号：CN102408490A)，增加了对发酵液进行酶处理环节，同时使用了膜过滤技术，但也是通过碱液溶发酵产物、酸液析出胶体、乙醇脱水、干燥、粉碎的工艺路线得到可得然多糖精制品。上述分离提纯的方法，虽然减少了乙醇的用量，但提纯过程中需要大量的碱液、酸液的中和反应，酸、碱原料大量浪费，成本高；同时中和产生的大量盐，也不符合环保要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述，提供一种利用金属盐离子从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法，包括以下工艺步骤：(1)发酵液经离心或板框过滤，弃去上清液，收集菌体；(2)在搅拌的条件下，将离心收集到的沉淀物，按照1-2％(质量百分含量)的比例，溶解于0.2-0.5M的氢氧化钠或氢氧化钾碱溶液，离心或板框过滤去除菌体；(3)上清液加0.1％-0.5％(质量百分含量)的钙盐或镁盐溶液，离心或压榨得到胶体沉淀物；(4)向胶体沉淀物中加入胶体2-4倍质量的去离子水，加酸溶液搅拌胶体调节pH至5-8，离心或压榨脱水；(5)胶体用去离子水洗涤2-4次，离心或压榨脱水；(6)所得中性胶体，用胶体2-4倍质量的95％乙醇浸泡5-10分钟，离心或压榨去除乙醇；(7)将所得胶体干燥、粉碎即得到可得然多糖精制品。所述的微生物发酵液优选产可得然多糖的土壤杆菌发酵液。步骤(1)离心去除上清液的条件优选：转速5000-10000rmp，离心10-30分钟。步骤(2)发酵液中所加碱溶液优选氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为0.2-0.5M。步骤(3)所述的钙盐优选氯化钙，所述的镁盐为氯化镁；所述的钙盐或镁盐的添加量为溶液的0.1wt％-0.5wt％。步骤(4)所述的酸溶液优选盐酸、硫酸、乙酸、磷酸、柠檬酸中的任意一种。步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)中离心条件为：转速5000-10000rmp，离心10-30分钟。步骤(7)中所述的干燥方法为自然干燥、真空干燥、热风干燥、超声热风干燥法中的任意一种。本专利技术方法所有操作步骤的温度不超过55℃。有益效果：可得然多糖精制品，是发酵液去除菌体后获得的可得然多糖纯品，能够直接应用于素鲍鱼、果冻、面制品、肉制品等食品加工行业。原有可得然多糖分离方法存在不同的问题：发酵液碱溶液处理，再经乙醇沉淀提纯可得然多糖的方法，乙醇用量大，成本高；而用酸中和发酵液碱液，再收集胶体的方法，酸碱原理的使用量大，成本高，同时产生的大量盐也不符合环保要求。本专利技术不同于已有的从发酵液中分离提纯可得然多糖的方法。碱液处理的发酵液去除菌体后，是通过向发酵液碱液中添加钙离子或镁离子盐，而形成可逆可得然胶体。收集胶体过程中离心去除的碱液可达到70％以上，这部分碱液可以重复使用。收集的胶体中，只含30％左右的碱液，大大降低酸溶液的使用。因此，本专利技术中的可得然多糖分离提纯工艺，既解决了乙醇沉淀法中，乙醇使用量大的问题，又有效的降低了酸、碱原料的使用，同时产生的盐也随之减少，满足环保要求。附图说明图1可得然多糖分离提纯工艺示意图具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述，但不是对本专利技术的限定，任何依据本
技术实现思路
所作的等效技术手段的替换，均不脱离本专利技术的保护范围。本专利技术所涉及的可得然多糖分离提取工艺，不仅限于从土壤杆菌发酵液分离提纯可得然多糖，从其他产可得然多糖的微生物发酵液进行分离提纯工艺，也在本专利技术的保护范围之内。实施例1本专利提供的方法提取可得然多糖(1)发酵培养基：葡萄糖5％、(NH)2HPO40.1％、KH2PO40.3％、MgSO4.7H2O0.2％、CaCO3(1000目)0.2％、玉米浆0.2％，以上均为质量百分含量，调节溶液PH至7。(2)发酵菌种为土壤杆菌ATCC31749，采用50L发酵罐，发酵培养基装液量30L、发酵培养温度30℃、搅拌转速180r/min培养周期96h，发酵生产可得然多糖。(3)土壤杆菌ATCC31749发酵结束后，发酵液经离心或板框过滤，弃去上清液，收集菌体，离心条件是转速10000rmp，离心时间是20分钟。(4)将收集的菌体按照1.5％(质量百分含量)的比例，在搅拌条件下，加入到0.3M的氢氧化钠碱溶液。(5)得到的碱溶液经离心去除不溶性菌体，离心条件是转速10000rmp，离心时间是20分钟。(6)得到的上清液加入氯化钙，添加量为上清液的0.2％(质量百分比)；离心得到胶体沉淀物。离心条件是转速8000rmp，离心时间是20分钟。(7)离心收集的胶体，加入3倍质量的去离子水，加盐酸(浓度为3M)溶液搅拌胶体调节pH至6，离心脱水；离心脱水的条件是转速10000rmp，离心时间是20分钟。(8)离心所得胶体用去离子水洗涤3次，离心脱水；离心条件是转速10000rmp，离心时间是20分钟。(9)离心所得中性胶体，用3倍质量的95％乙醇浸泡10分钟，离心去除乙醇。离心的条件是转速10000rmp，离心时间20分钟。(10)离心沉淀物放入烘箱中，在55℃条件下烘干，待完全干燥后放入研钵中研碎，过100目筛子，即得到可得然多糖精制品。(11)测定凝胶强度：将可得然多糖精制品用纯水配制成2％(质量百分含量)悬浊液，均质机均质后，90℃水浴条件加热处理10分钟，4℃冷却5分钟，得到不可逆凝胶，并采用质构仪测定凝胶强度。实施例2不同提取方法得到的可得然多糖精制品性质比较以提取1L发酵液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：(1)发酵液经离心或板框过滤，弃去上清液，收集菌体；(2)在搅拌条件下，将离心收集到的沉淀物，溶解于氢氧化钠或氢氧化钾碱溶液中，离心或板框过滤，去除不溶性菌体沉淀；(3)上清液加钙盐或镁盐溶液，离心或压榨得到胶体沉淀物；(4)向胶体沉淀物中加入胶体2‑4倍质量的去离子水，加酸溶液搅拌胶体调节pH至5‑8，离心或压榨脱水；(5)胶体用去离子水洗涤2‑4次，离心或压榨脱水；(6)所得中性胶体，用胶体2‑4倍质量的95％乙醇浸泡5‑10分钟，离心或压榨去除乙醇；(7)将所得胶体干燥、粉碎即得到可得然多糖精制品。

【技术特征摘要】
1.一种从微生物发酵液中分离提纯可得然多糖的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：(1)发酵液经离心或板框过滤，弃去上清液，收集菌体；(2)在搅拌条件下，将离心收集到的沉淀物，溶解于氢氧化钠或氢氧化钾碱溶液中，离心或板框过滤，去除不溶性菌体沉淀；(3)上清液加钙盐或镁盐溶液，离心或压榨得到胶体沉淀物；(4)向胶体沉淀物中加入胶体2-4倍质量的去离子水，加酸溶液搅拌胶体调节pH至5-8，离心或压榨脱水；(5)胶体用去离子水洗涤2-4次，离心或压榨脱水；(6)所得中性胶体，用胶体2-4倍质量的95％乙醇浸泡5-10分钟，离心或压榨去除乙醇；(7)将所得胶体干燥、粉碎即得到可得然多糖精制品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微生物发酵液为产可得然多糖的土壤杆菌发酵液。3.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张充，步国建，张晓健，王克琴，
申请(专利权)人：南京农业大学，泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32